Gs-AC-cAMP-PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)與氟性骨損傷的關(guān)聯(lián).pdf

1、目的：采用UMR-106大鼠骨肉瘤細(xì)胞和Wistar大鼠為研究對(duì)象，從細(xì)胞到整體動(dòng)物水平，全面分析氟中毒狀態(tài)下，Gs與 Gi調(diào)控的Gs-AC-cAMP-PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路各因子的表達(dá)變化，為進(jìn)一步明確Gs-AC-cAMP-PKA信號(hào)通路在氟骨癥中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法：1.氟化鈉對(duì)UMR-106細(xì)胞的影響及其與Gs/Gi-AC-cAMP-PKA信號(hào)通路表達(dá)的關(guān)系。（1）0、50、100、500、1000、5000、10000、

2、20000、40000、80000?mol/L NaF作用UMR-106細(xì)胞24h、48h，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的存活情況，明確后續(xù)實(shí)驗(yàn)作用濃度及時(shí)間。（2）0、1000、2000、4000?mol/L NaF作用UMR-106細(xì)胞24h后，磷酸苯二鈉法檢測(cè)ALP活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡情況，qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)BGP、Gs、Gi、AC、PKA mRNA表達(dá)水平。2.氟化鈉對(duì)Wistar大鼠骨組織中Gs/Gi-AC

3、-cAMP-PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達(dá)影響。48只斷乳2周 Wistar大鼠按體重隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組（自來(lái)水）和低劑量組（50mg/L NaF）、中劑量組（150 mg/L NaF）、高劑量組（250 mg/L NaF），每組12只，雌雄各半。采用自由飲水方式染毒，連續(xù)染毒6個(gè)月。檢測(cè)大鼠尿氟、骨氟、牙氟及血清氟濃度及氟斑牙發(fā)生率；比色法檢測(cè)大鼠骨組織中抑制羥自由基能力、CAT、GSH-Px、SOD的活力及ELISA方法檢測(cè)8-OH

4、dG、PCO、MDA、Gs、Gi、AC、cAMP、PKA的濃度。
　　結(jié)果：1.氟化鈉對(duì) UMR-106細(xì)胞的影響及其與Gs/Gi-AC-cAMP-PKA信號(hào)通路表達(dá)的關(guān)系（1）CCK-8檢測(cè)結(jié)果：作用24h時(shí)，1000~80000μmol/L NaF組UMR-106細(xì)胞存活率較對(duì)照組低（P<0.05）；作用48h時(shí)，50~80000μmol/LNaF組UMR-106細(xì)胞存活率較對(duì)照組低（P<0.05）。確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)作用濃度為0、

5、1000、2000、4000?mol/L，作用時(shí)間為24h。（2）ALP及BGP檢測(cè)結(jié)果：各NaF處理組在UMR-106細(xì)胞的培養(yǎng)液及細(xì)胞中的ALP活力均較對(duì)照組高（P<0.05）；2000、4000?mol/L NaF組BGP mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組高（P<0.05）。（3）細(xì)胞周期及凋亡檢測(cè)結(jié)果：1000、4000?mol/L NaF組細(xì)胞數(shù)量在G0/G1期所占比例較對(duì)照組低（P<0.05），2000?mol/L NaF組細(xì)胞數(shù)

6、量在G0/G1期所占比例高于其余各組（P<0.05）；2000?mol/L NaF組細(xì)胞數(shù)量在S期所占比例較其余各組低（P<0.05）；4000?mol/L NaF組細(xì)胞數(shù)量在G2/M期所占比例較其余各組低（P<0.05）；1000及4000?mol/L NaF組PI較對(duì)照組高，2000?mol/L NaF組較對(duì)照低（P<0.05）。1000?mol/LNaF組凋亡率較對(duì)照組低，2000、4000?mol/L NaF組凋亡率較對(duì)照組高（

7、P<0.05）。（4）Gs、Gi、AC、PKA mRNA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果：2000?mol/L NaF組PKA、4000?mol/L NaF組Gs及PKA的mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組高（P<0.05）；各實(shí)驗(yàn)組Gi與AC基因mRNA相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。2.氟化鈉對(duì) wistar大鼠骨組織中Gs/Gi-AC-cAMP-PKA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達(dá)影響。（1）氟中毒動(dòng)物模型建立指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果：對(duì)照組無(wú)氟斑牙發(fā)生，各劑量NaF染毒

8、組氟斑牙檢出率為100％；各劑量NaF染毒組大鼠尿氟、牙氟、骨氟、血清氟濃度均較對(duì)照組高（P<0.05）。（2）大鼠骨組織氧化損傷指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果：中劑量組大鼠骨組SOD及中、高劑量組CAT、抑制羥自由基能力均較對(duì)照組低（P<0.05）；低劑量大鼠組骨組織 GSH-Px高于其余組（P<0.05）；各劑量組大鼠骨組織 PCO高于對(duì)照組（P<0.05）。各組大鼠骨組織8-OHdG與MDA之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（3）大鼠骨組織Gs、Gi、AC、c

9、AMP及PKA含量在各NaF染毒組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：1.氟化鈉可促進(jìn)UMR-106細(xì)胞ALP活性、增加BGP mRNA表達(dá)。2.高濃度氟化鈉可影響UMR-106細(xì)胞周期，延長(zhǎng)G0/G1或S期，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。3.高濃度氟化鈉可增加UMR-106細(xì)胞Gs、PKA mRNA表達(dá)。4.成功建立了慢性氟中毒大鼠模型。5.150、250mg/L NaF可能致大鼠骨組織氧化損傷。6.采用ELISA方法