1,25-二羥基維生素D3對實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎腸黏膜屏障的保護(hù)作用與機(jī)制研究.pdf

1、潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)是一種高復(fù)發(fā)的腸道炎性疾病，是我國炎癥性腸?。↖nflammatory Bowel Disease，IBD）的主要臨床形式之一。由于其發(fā)病機(jī)制不明，目前尚無有效防治措施，因此，研究UC的發(fā)病機(jī)制，探索有效的防治措施具有重要意義。
　　 目前認(rèn)為UC發(fā)病是由于腸道共生菌及其產(chǎn)物突破腸黏膜屏障，誘導(dǎo)黏膜局部發(fā)生持續(xù)的免疫反應(yīng)，引發(fā)組織炎癥。正常情況下，腸道上皮細(xì)胞組成一道完整

2、的黏膜屏障，阻止微生物及毒性大分子通過，可見腸黏膜屏障完整性是阻止細(xì)菌入侵及移位的關(guān)鍵。眾所周知，緊密連接(Tight Junction，TJ)是細(xì)胞間的重要連接方式，對維持黏膜屏障的完整性起決定作用。因此，腸上皮緊密連接受損在UC的發(fā)病中扮演著關(guān)鍵角色。
　　 腸黏膜屏障功能缺陷時，微生物抗原可以進(jìn)入腸黏膜固有層，從而誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞活化，啟動黏膜免疫反應(yīng)；研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T細(xì)胞是腸黏膜炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，其輔助細(xì)胞亞群—

3、—Th17細(xì)胞以分泌白細(xì)胞介素17(IL-17)為主，后者是一種促炎因子，具有強(qiáng)大的募集和激活嗜中性粒細(xì)胞的能力，能誘導(dǎo)活化T細(xì)胞產(chǎn)生多種促炎介質(zhì)如IL-1、IL-6、TNF-α等而誘發(fā)加重炎癥反應(yīng)。因此，深入探討UC發(fā)病中腸黏膜屏障的作用與免疫調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要意義。
　　 1，25-二羥基維生素D3(1，25-dihydroxyvitamin D3，1，25(OH)2D3)是機(jī)體內(nèi)維生素D的活性形式，也是一種具有生物活性的類固

4、醇激素，具有明確的抗感染作用，其缺乏可致呼吸道、消化道黏膜等部位感染風(fēng)險(xiǎn)明顯增高。研究顯示，1，25(OH)2D3可抑制炎性細(xì)胞因子、上調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá)。同時，1，25(OH)2D3也具有免疫調(diào)節(jié)作用，流行病學(xué)研究表明，在混合型結(jié)締組織病患者中1，25(OH)2D3缺乏明顯，其中1，25(OH)2D3的缺乏程度與血清中IFN-γ、IL-6、IL-17含量呈正比。1，25(OH)2D3的產(chǎn)生與作用不足可能參與了UC的發(fā)病，我們推測1，

5、25(OH)2D3可能通過調(diào)節(jié)腸道緊密連接蛋白表達(dá)，從而維持黏膜屏障完整性，抑制致病菌入侵及移位，因此，本實(shí)驗(yàn)對1，25(OH)2D3在急、慢性期實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎腸黏膜屏障中的保護(hù)作用與機(jī)制進(jìn)行了深入研究，具體實(shí)驗(yàn)分為以下四部分：
　　 第一部分、1，25-二羥基維生素D3改善急、慢性期實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠腸黏膜炎癥
　　 目的：觀察1，25(OH)2D3對急、慢性期實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠腸黏膜炎癥的影響。
　　 方法：①通過

6、飲用2％右旋葡聚糖硫酸鈉（Dextran sodium sulfate，DSS）7天可以成功建立急性期實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型，C57B/L小鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、1，25(OH)2D3組，每組10只；1，25(OH)2D3組應(yīng)用1，25(OH)2D3灌胃(0.2μg/25g體重，1次/天)，正常對照組和模型組均用等體積PBS灌胃，共14天。慢性期實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型則通過在第1～5天、8～12天、15～19天和22～26天的時間段內(nèi)飲用2

7、％的DSS，第27、28天及其它時間飲用蒸餾水成功建立，C57B/L小鼠隨機(jī)分為3組：正常對照組、模型組、1，25(OH)2D3組，每組10只。1，25(OH)2D3組在模型建立第14天時即給予1，25(OH)2D3（0.005μg/d，1次/d，溶于花生油中）灌胃，正常對照組及模型組以同體積的花生油灌胃，第29天處死動物；②腸黏膜炎癥改變的評估包括每天體重(Body weight，BW)改變、疾病活動指數(shù)(Disease activi

8、ty index，DAI)、結(jié)腸長度、重量變化等指標(biāo)，以及結(jié)腸形態(tài)學(xué)改變和病理評分；③采用掃描電鏡觀察結(jié)腸組織上皮黏膜超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 結(jié)果：①在急性期結(jié)腸炎小鼠模型中，與正常對照組相比，模型組動物體重明顯減輕，給予1，25(OH)2D3干預(yù)后，1，25(OH)2D3組動物體重較模型組明顯回升；模型組動物DAI評分(3.00±0.41vs0.00±0.00，P＜0.01)及病理評分明顯增加（8.60±1.67vs5.00±0

9、.00，P＜0.01）明顯高于正常對照組，結(jié)腸長度縮短(4.88cm±0.63cmvs6.80cm±0.27cm，P＜0.01)，結(jié)腸壁充血、水腫明顯(2.00±0.71vs0.00±0.00，P＜0.01)，結(jié)腸組織病理切片顯示中性粒細(xì)胞浸潤明顯；但給予1，25(OH)2D3干預(yù)后，1，25(OH)2D3組DAI評分(0.00±0.00vs0.70±0.41，P＜0.01)及病理評分(7.40±0.55 vs8.60±1.67，P＜0

10、.01)較模型組顯著降低，同時結(jié)腸長度有所增長(6.10cm±0.42cmvs4.88cm±0.63cm，P＜0.01)，結(jié)腸壁充血及水腫明顯減輕(0.60±0.55vs2.00±0.71，P＜0.01)，結(jié)腸組織病理切片提示中性粒細(xì)胞浸潤明顯減少；②在慢性期實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠模型中，與正常對照組相比，模型組動物體重明顯減輕，經(jīng)1，25(OH)2D3干預(yù)后，1，25(OH)2D3組動物體重較模型組明顯回升；與正常對照組相比，模型組動物DA

11、I積分增加（4.00±0.43 vs0.00±0.00，P＜0.01），結(jié)腸長度明顯縮短（5.03cm±0.56 cm vs5.98cm±0.44cm，P＜0.01），結(jié)腸壁充血、水腫明顯(2.17±0.98 vs0.00±0.00，P＜0.01)，結(jié)腸組織病理切片顯示中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤明顯，直腸、近端結(jié)腸、末端回腸病理評分顯著增加（8.80±0.45 vs5.40±0.55、9.80±0.45 vs5.40±0.55、8.80±

12、0.84 vs5.40±0.55，P＜0.01）；但經(jīng)過1，25(OH)2D3干預(yù)后，1，25(OH)2D3組DAI評分顯著降低（0.30±0.46 vs0.70±0.30，P＜0.01），結(jié)腸長度增加不明顯（5.27±0.46 vs5.03±0.56，P<0.05）及直腸、近端結(jié)腸、末端回腸病理評分較模型組明顯降低(8.60±0.55 vs8.80±0.45、9.00±0.71 vs9.80±0.45、8.00±0.89 vs8.80

13、±0.84，P＜0.05)，結(jié)腸壁充血、水腫明顯減輕（1.33±0.52 vs2.17±0.98，P＜0.01），結(jié)腸組織病理切片結(jié)果提示淋巴細(xì)胞浸潤明顯減少；③掃描電鏡(Scanning electron microscope，SEM)觀察結(jié)果表明，正常對照組小鼠結(jié)腸組織上皮完整，無損傷；模型組則表現(xiàn)為典型炎癥黏膜紊亂，部分黏膜缺失，但經(jīng)過1，25(OH)2D3干預(yù)后，1，25(OH)2D3組黏膜缺失較模型組減輕，偶見隱窩擴(kuò)大。

14、>　　 結(jié)論：1，25(OH)2D3可以減輕急、慢性期UC小鼠腸黏膜炎癥反應(yīng)。
　　 第二部分、1，25-二羥基維生素D3對急、慢性期實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎腸黏膜屏障的保護(hù)作用
　　 目的：觀察1，25(OH)2D3對急、慢性期實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型小鼠結(jié)腸黏膜屏障的保護(hù)作用。
　　 方法：①造模方法同第一部分；②對各組動物腸系膜淋巴結(jié)勻漿液進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)以明確有無大腸桿菌感染；③通過熒光分光光度計(jì)檢測小鼠血清中異硫氫酸熒光素葡

15、聚糖(fluorescein isothiocyanate-dextran，F(xiàn)ITC-D)的含量；偶氮基質(zhì)顯色法檢測血清中脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）含量；④采用免疫組織化學(xué)染色法、免疫熒光染色法、western blot和real-time Q-PCR技術(shù)檢測急、慢性期模型各組小鼠結(jié)腸組織中閉鎖蛋白(occludin)、水閘蛋白(claudin)和閉鎖小帶(zonula occludens，Zos)蛋白及其m

16、RNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：①與正常對照組相比，模型組小鼠血清中FITC-D和LPS的含量顯著增加（FITC-D:933.4±133.5 vs4266.8±326.6,P＜0.01;LPS:0.119±0.05 vs0.224±0.06,P＜0.01）；而1,25(OH)2D3組小鼠血清中FITC-D和LPS的含量較模型組明顯降低(FITC-D:253.4±222.9 vs4266.8±326.6,P＜0.01;LPS:0.13

17、8±0.06 vs0.224±0.06,P＜0.01)。②正常對照組小鼠腸系膜淋巴結(jié)勻漿液中無細(xì)菌移位(0％)，與正常對照組相比，模型組小鼠細(xì)菌移位率明顯增加(80％)，而1,25(OH)2D3組，淋巴結(jié)細(xì)菌移位較模型組明顯降低(40％)。③免疫組織化學(xué)染色及免疫熒光染色檢測結(jié)果顯示：急、慢性期模型組小鼠腸組織中zo-1、occludin和claudin-1蛋白表達(dá)水平較正常對照組顯著降低，而1,25(OH)2D3組zo-1、occlu

18、din和claudin-1蛋白表達(dá)水平較模型組明顯增加。④Western blot和real-time Q-PCR檢測結(jié)果顯示：在急性期小鼠模型中，與正常對照組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中zo-1、occludin和claudin-1蛋白和mRNA表達(dá)明顯降低（蛋白：0.60±0.05 vs1.37±0.04、0.11±0.01 vs0.25±0.03、0.44±0.04 vs0.95±0.04,P＜0.05;mRNA:0.46±0.03

19、 vs1.00±0.07、0.36±0.02 vs1.00±0.04和0.85±0.05 vs1.00±0.05,P＜0.01）；而1,25(OH)2D3組與模型組比較小鼠結(jié)腸組織中zo-1、occludin和claudin-1蛋白和mRNA表達(dá)明顯增加（蛋白：1.31±0.15 vs0.60±0.05、0.23±0.03 vs0.11±0.01、0.93±0.01 vs0.44±0.04,P＜0.05;mRNA:0.97±0.04 v

20、s0.46±0.03、0.98±0.01 vs0.36±0.02、1.00±0.04 vs0.85±0.05,P＜0.01）。在慢性期小鼠模型中：與正常對照組相比，模型組小鼠直腸、近端結(jié)腸、末端回腸組織中zo-1、occludin和claudin-1蛋白（zo-1:0.98±0.03 vs1.56±0.02、0.34±0.03 vs0.76±0.020、0.24±0.02 vs0.65±0.03,P＜0.01;occludin:1.48

21、±0.03 vs1.56±0.03、1.64±0.02 vs1.76±0.03、1.44±0.03 vs1.65±0.02,P＜0.01;claudin-1:1.10±0.03 vs1.36±0.03、1.04±0.02 vs1.66±0.03、1.44±0.03 vs1.85±0.02,P＜0.01)和mRNA(zo-1:0.83±0.05 vs1.03±0.05、0.60±0.04 vs1.01±0.05、0.69±0.03 vs1

22、.02±0.05,P＜0.01;occludin:0.90±0.04 vs1.01±0.05、0.93±0.04 vs1.03±0.05、0.90±0.05 vs1.04±0.05,P＜0.01;claudin-1:0.77±0.02 vs1.02±0.05、0.55±0.02 vs1.01±0.05、0.66±0.03 vs1.04±0.05,P＜0.01）表達(dá)水平明顯下降；而1,25(OH)2D3組與模型組小鼠比較直腸、近端結(jié)腸、末

23、端回腸組織中zo-1、occludin和claudin-1蛋白（zo-1:1.35±0.02 vs0.83±0.05、0.63±0.02 vs0.34±0.03、0.55±0.02 vs0.24±0.02,P＜0.01;occludin:1.45±0.02 vs1.48±0.03、1.63+0.02 vs1.64±0.02、1.56±0.02 vs1.44±0.03,P＜0.01;claudin-1:1.25+0.02 vs1.10±0

24、.03、1.43±0.02 vs1.04±0.02、1.65±0.02 vs1.44±0.03,P＜0.01)和mRNA(zo-1:0.94±0.02 vs0.83±0.05、0.67±0.01 vs0.60±0.04、0.74±0.01 vs0.69±0.03，P＜0.01;occludin:0.94±0.02 vs0.90±0.04、0.94±0.03 vs0.93±0.04、0.94±0.01 vs0.90±0.05,P＜0.01

25、;claudin-1:0.84±0.02 vs0.77±0.02、0.77±0.02 vs0.55±0.02、0.74±0.01 vs0.66±0.03，P＜0.01)表達(dá)水平明顯增加。
　　 結(jié)論：1，25(OH)2D3有助于改善炎癥引起的腸道黏膜損傷，其機(jī)制可能與降低腸黏膜屏障的通透性、維持黏膜屏障結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)。
　　 第三部分、1，25-二羥基維生素D3對慢性期實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎CD4+T細(xì)胞功能的影響
　　

26、目的：探討1，25(OH)2D3對DSS誘導(dǎo)的慢性期實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型小鼠CD4+T細(xì)胞功能的影響。
　　 方法：①觀察脾臟長度、脾臟重量變化；②分離脾臟單個核細(xì)胞數(shù)并計(jì)數(shù)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟單個核細(xì)胞中免疫細(xì)胞的陽性率；③分離結(jié)腸黏膜固有層、腸系膜淋巴結(jié)中單個核細(xì)胞數(shù)并計(jì)數(shù)；④應(yīng)用real-timeQ-PCR技術(shù)分析結(jié)腸組織中炎性細(xì)胞因子TNF-αmRNA、IFN-γ mRNA、IL-17 mRNA、IL-6 mRNA的表達(dá)

27、變化。
　　 結(jié)果：①同正常對照組相比，DSS模型組小鼠脾臟長度、重量增加，（脾臟長度：1.37cm±0.27cm vs1.22cm±0.12cm，P＞0.05;脾臟重量：0.09g±0.02g vs0.06g±0.02g，P＞0.05）而給予1，25(OH)2D3干預(yù)后，同DSS模型組相比，小鼠脾臟長度稍下降、重量稍減輕（脾臟長度：1.32cm±0.12cm vs1.37cm±0.27cm;脾臟重量：0.084g±0.02g

28、vs0.09g±0.02g)但均P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；②細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，1，25(OH)2D3組脾臟單個核細(xì)胞數(shù)量較DSS模型組顯著減少(76.80×106±18.60×106/mL vs108.00×106±20.30×106/mL，P＜0.01）；進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟單個核細(xì)胞中免疫細(xì)胞所占的陽性比率，結(jié)果顯示給予1，25(OH)2D3干預(yù)后，小鼠脾臟單個核細(xì)胞中CD3、CD4、CD8、CD45R細(xì)胞陽性率與模型組比

29、較顯著降低(36.58％±0.70％ vs54.10％±0.97％、19.80％±0.73％ vs29.02％±0.68％、14.40％±0.70％ vs18.82％±0.54％、26.82％±0.47％ vs54.40％±0.87％，P＜0.01）；③給予1，25(OH)2D3干預(yù)后，1，25(OH)2D3組小鼠腸系膜淋巴結(jié)（Mesenteric lymph node，MLN）和結(jié)腸黏膜固有層單個核細(xì)胞（Lamina propria

30、mononuclear cells，LPMC）數(shù)量與模型組相比顯著降低（MLN:2.52×106/mL±0.74×106/mL vs3.42×106/mL±0.40×106/mL,P＜0.01;LPMC:0.32×106/mL±0.14×106/mL vs0.88×106/mL±0.08×106/mL，P＜0.01);④Real-time Q-PCR檢測結(jié)果顯示，與DSS模型組相比，給予1，25(OH)2D3干預(yù)后，1，25(OH)2D

31、3組結(jié)腸組織中TNF-α mRNA、IFN-γ mRNA、IL-17 mRNA和IL-6 mRNA表達(dá)水平均顯著降低(5.48±0.08 vs9.30±0.07、7.74±0.11 vs14.38±0.08、3.28±0.11 vs6.38±0.08、4.54±0.10 vs7.38±0.07,P＜0.01)。
　　 結(jié)論：1，25(OH)2D3可減輕DSS誘導(dǎo)的小鼠慢性期結(jié)腸炎的腸損傷，其機(jī)制可能與降低脾臟單個核細(xì)胞中免疫細(xì)胞

32、的陽性率以及抑制腸組織中的TNF-α、IFN-γ、IL-17、IL-6等細(xì)胞因子有關(guān)。
　　 第四部分、1，25-二羥基維生素D3對體外Caco-2細(xì)胞屏障的保護(hù)作用與機(jī)制研究
　　 目的：探討1，25(OH)2D3對DSS誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞屏障的保護(hù)作用與機(jī)制研究。
　　 方法：①Caco-2細(xì)胞形成體外腸上皮細(xì)胞屏障模型后，實(shí)驗(yàn)分為vehical組（溶劑對照組）、DSS組、1，25(OH)2D3

33、10-9M組、1，25(OH)2D310-8M組和1，25(OH)2D310-7M組；②通過測量單層上皮的電阻（Transepithelial electrical resistance，TEER）和熒光素異硫氰酸酯葡聚糖(Fluorescein isothiocyanate dextran，F(xiàn)ITC-D)通透率檢測單層細(xì)胞的電阻與通透率改變；③應(yīng)用透射電鏡觀察1，25(OH)2D3干預(yù)后Caco-2單層細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變；④采用免疫熒

34、光染色方法、Western blot技術(shù)和real-time Q-PCR方法檢測zo-1、occludin和claudin-1的蛋白及其mRNA在單層細(xì)胞的表達(dá)。
　　 結(jié)果：①體外腸上皮細(xì)胞屏障模型成功建立；②對FITC-D通透率的結(jié)果分析顯示：DSS組較vehical組明顯升高（51.83±2.48 vs5.5±1.05，P＜0.01），1，25(OH)2D310-9M組、1,25(OH)2D310-8M組和1,25(OH)

35、2D310-7M組則較DSS組顯著降低（18.5±1.05，8.17±1.17，18.5±1.05，P＜0.01）；進(jìn)一步采用透射電鏡觀察，顯示DSS組細(xì)胞的緊密連接樣結(jié)構(gòu)消失，而1，25(OH)2D3各劑量組細(xì)胞的緊密連接樣結(jié)構(gòu)有不同程度的恢復(fù)，但仍未能完全恢復(fù)正常；③免疫熒光染色結(jié)果表明：vehical組zo-1、occludin和claudin-1蛋白表達(dá)連續(xù)完整，熒光密度強(qiáng)度高；DSS組上述三種蛋白表達(dá)斷續(xù)不完整，熒光強(qiáng)度弱；而

36、1，25(OH)2D310-9M組、1，25(OH)2D310-8M組和1，25(OH)2D310-7M組較DSS組明顯好轉(zhuǎn)；④Western blot對zo-1、occludin、claudin-1蛋白檢測結(jié)果顯示：DSS組較vehical組顯著降低(0.80+0.16 vs1.51±0.20、0.99±0.13 vs1.66±0.14、0.76±0.09 vs1.79±0.11,P＜0.01)，而給予1，25(OH)2D310-8M

37、治療后，其緊密連接zo-1、occludin和claudin-1蛋白表達(dá)水平明顯高于DSS組(1.20±0.12 vs0.80±0.16、1.47+0.13 vs0.99±0.13、1.68±0.11 vs0.76±0.09,P＜0.01),1,25(OH)2D310-9M，1，25(OH)2D310-7M干預(yù)后，其緊密連接occludin和claudin-1蛋白的表達(dá)水平與DSS組相比明顯增加，P＜0.01；但1，25(OH)2D31

38、0-9M，1，25(OH)2D310-7M干預(yù)后，zo-1蛋白表達(dá)水平與DSS組相比無明顯增加，P＞0.05；Real-timeQ-PCR檢測結(jié)果顯示：DSS組較vehical組顯著降低(0.67+0.11 vs1.00±0.00、0.63±0.07 vs1.00±0.00、0.70±0.07 vs1.00±0.00,P＜0.01），而給予1，25(OH)2D310-8M治療后，其緊密連接zo-1 mRNA、occludin mRNA、

39、claudin-1 mRNA表達(dá)水平與DSS組相比，明顯增加(0.84+0.08 vs0.67±0.11、0.84±0.08 vs0.63±0.07、0.9±0.08 vs0.70±0.07,P＜0.01），1，25(OH)2D310-9M，1，25(OH)2D310-7M干預(yù)后，其緊密連接zo-1mRNA、occludin mRNA、claudin-1 mRNA的表達(dá)水平與DSS組相比也明顯增加，P＜0.01。
　　 結(jié)論：體