高同型半胱氨酸血癥與慢性腎臟病患者心腦血管疾病的關(guān)系研究.pdf

1、背景：
　　 同型半胱氨酸(Homocysteinemia，Hcy)是人體內(nèi)蛋氨酸代謝的中間產(chǎn)物，各種原因?qū)е碌难褐锌侶cy(total Hcy，tHcy)的濃度病理性升高稱為高同型半胱氨酸血癥(Hyperhomocysteinemia，HHC)[1]。很多因素可引起血漿tHcy升高，如葉酸、維生素B缺乏、各種原因?qū)е碌哪I臟損傷及服用藥物等。大量流行病學(xué)資料發(fā)現(xiàn)，HHC是人群心腦血管疾病發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子[1-7]。慢性腎臟病

2、(chronickidney disease，CKD)是導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥的重要原因之一，當(dāng)患者腎功能水平逐漸減退至終末期腎臟病(end stage renal disease，ESRD)需要透析治療時(shí)，超過(guò)90％的患者同時(shí)伴有中等水平的高同型半胱氨酸血癥(>15μmol/L)[8]，而心腦血管病變是CKD患者的重要并發(fā)癥。Moustapha等[9]研究發(fā)現(xiàn)，血漿tHcy水平升高與ESRD患者心、腦血管病變發(fā)病率升高有關(guān)，血漿tHc

3、y濃度每增加1μmol/L，CVD相對(duì)危險(xiǎn)性增加1％。但Wald等人[10]進(jìn)行的一項(xiàng)薈萃分析顯示tHcy每增高5μmol/L，心血管事件的危險(xiǎn)率增高32％，腦卒中風(fēng)險(xiǎn)升高59％。按此推理，在CKD患者中高同型半胱氨酸血癥發(fā)生率如此之高，心腦血管事件的危險(xiǎn)性會(huì)出現(xiàn)成倍增加，而事實(shí)并非如此。所以，CKD患者的HHC是否是其高心腦血管病變發(fā)生率的危險(xiǎn)因素以及其作用機(jī)制目前尚有爭(zhēng)議。
　　 血細(xì)胞來(lái)源的組織因子(TF)在病理性血栓中的

4、作用已有廣泛的研究。其中Mo TF與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展及血栓形成有密切的關(guān)系[11，12]。新近發(fā)現(xiàn)，AMI及不穩(wěn)定性心絞痛患者外周血中Mo TF的表達(dá)明顯高于穩(wěn)定性心絞痛的患者，AMI發(fā)作后的持續(xù)性高凝狀態(tài)與Mo的TF表達(dá)增高有關(guān)[13]。而AIS患者凝血、抗凝及纖溶活性改變?cè)谘ㄐ纬傻陌l(fā)病過(guò)程中亦具有重要意義[14-16]。其TF在血管內(nèi)不恰當(dāng)?shù)乇磉_(dá)引起血栓形成會(huì)導(dǎo)致致死性的栓塞。MoTF受多種因素影響，有報(bào)道表明Hcy能通過(guò)

5、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞TF的表達(dá)改變機(jī)體凝血和抗凝機(jī)制[17]，那么Hcy能否通過(guò)誘導(dǎo)單核細(xì)胞TF基因表達(dá)的上調(diào)從而導(dǎo)致CKD患者急性心腦血管血栓性疾病發(fā)病率增高，以及其誘導(dǎo)TF基因和蛋白表達(dá)的機(jī)制如何，迄今未見(jiàn)此類報(bào)道。我們進(jìn)行了一系列臨床病例采集和實(shí)驗(yàn)室研究，探討Hcy在CKD患者心腦血管病變發(fā)生中的地位及其具體作用機(jī)制。
　　 第一部分
　　 目的：觀察慢性腎臟病(CKD)患者血漿總同型半胱氨酸(tHcy)水平與動(dòng)脈粥樣

6、硬化及心腦血管病變的關(guān)系。
　　 方法：取健康對(duì)照35例、慢性腎臟病患者90例(維持性血液透析患者50例)作為受試者，評(píng)估受試者心腦血管病變情況，檢測(cè)受試者各項(xiàng)生化指標(biāo)及血液指標(biāo)，以高效液相色譜法測(cè)定受試者血漿tHcy水平，采用彩色多普勒超聲檢查受試者頸動(dòng)脈內(nèi)一中膜層厚度(IMT)及粥樣斑塊的情況，評(píng)估CKD患者心腦血管病變發(fā)生情況，采取分組對(duì)照及相關(guān)分析和多元逐步Logistic回歸分析評(píng)價(jià)tHcy及各項(xiàng)指標(biāo)與CKD患者心、腦

7、血管疾病的關(guān)系。
　　 結(jié)果：1)CKD組中84.4％(76/90)的患者存在HHC(tHcy>15μmol/L)，且CKD組血漿tHcy濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；CKD患者中，73例合并心、腦血管病變者血漿tHcy濃度顯著高于無(wú)心、腦血管病變者(P<0.01)。
　　 2)CKD組頸動(dòng)脈IMT，斑塊陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。CKD高tHcy組(tHcy>15μmol/L)頸動(dòng)脈IMT，斑塊陽(yáng)性率及

8、心腦血管病變發(fā)生率顯著高于CKD正常tHcy組(P<0.05)；
　　 3)受試者血漿tHcy水平與IMT、斑塊陽(yáng)性率呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)血漿tHcy、TG、Hb是CKD患者并發(fā)心、腦血管病的危險(xiǎn)因素(r分別為0.351，0.712，0.199，P均<0.05)；
　　 結(jié)論：1)CKD患者存在HHC，且合并心、腦血管病變者血漿tHcy濃度顯著增高；2)CKD患者頸動(dòng)脈粥樣硬化及心腦血管發(fā)生率高于正常人群，且與血

9、漿tHcy水平有關(guān)聯(lián)；3)血漿tHcy水平是CKD患者動(dòng)脈粥樣硬化及并發(fā)心、腦血管病的危險(xiǎn)因素。
　　 第二部分
　　 目的：觀察CKD患者并發(fā)急性心腦血管血栓性疾病時(shí)血漿tHcy水平及其與凝血啟動(dòng)因子之一--單核細(xì)胞組織因子的關(guān)系，從而進(jìn)一步明確Hcy在CKD患者心腦血管并發(fā)癥中的地位，探討其可能的作用機(jī)制。
　　 方法：根據(jù)診斷學(xué)標(biāo)準(zhǔn)取CKD患者24例作為對(duì)照組，CKD患者中AMI患者10例，ASI患者9例，

10、以高效液相色譜法測(cè)定各組受試者tHcy，以雙夾心ELISA法測(cè)定血漿中TF抗原(TFAg)，以發(fā)色底物法檢測(cè)單核細(xì)胞膜表面TF活性(TFact)，行組間對(duì)照研究，并應(yīng)用相關(guān)分析和多元逐步Logistic回歸分析評(píng)價(jià)tHcy、單核細(xì)胞組織因子及各項(xiàng)指標(biāo)與心腦血管血栓性疾病的關(guān)系。
　　 結(jié)果：1)各組一般情況對(duì)照顯示AMI組和AIS組CKD患者無(wú)論吸煙、飲酒史還是高血壓、糖尿病、冠心病、腦梗發(fā)病率均高于對(duì)照組。AMI、AIS組血清

11、肌酐及甘油三酯水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但兩組間無(wú)差異，AMI組血清LDL-C顯著高于對(duì)照組和AIS組(P<0.05)，而AIS組與對(duì)照組無(wú)差異。
　　 2)CKD患者中AMI及ASI組血漿tHcy水平均高于對(duì)照組(P<0.05)，而AMI組及AIS組間無(wú)顯著差異。
　　 3)與對(duì)照組相比，AMI組與AIS組TF抗原均顯著增加(P<0.05)，AMI患者血漿中TF活性增高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，AI

12、S患者血漿中TF活性顯著升高(P<0.05)。AIS組的血漿TF活性顯著地高于AMI組(P<0.05)。
　　 4)CKD患者對(duì)照組，AMI及AIS組tHcy與TFAg、TF活性均有相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，但組間差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 5)CKD患者多元逐步Logistic回歸分析，結(jié)果顯示血漿tHcy、LDL-C是CKD患者并發(fā)急性心腦血管血栓性疾病的危險(xiǎn)因素(回歸系數(shù)分別為0.194，0.114

13、)。
　　 結(jié)論：在CKD患者急性心腦血管血栓性疾病中，患者tHcy和TF水平均顯著增高，且二者呈正相關(guān)，提示tHcy可能與Mo TF產(chǎn)生增加有關(guān)，導(dǎo)致急性心腦血管血栓性疾病的發(fā)生。
　　 第三部分
　　 目的：通過(guò)對(duì)不同濃度的Hcy培養(yǎng)下，CKD患者外周血Mo TF基因和蛋白表達(dá)的情況，核因子NF-кB抑制劑對(duì)Hcy誘導(dǎo)人血Mo TF的表達(dá)的影響作用，探討Hcy對(duì)Mo TF轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的作用機(jī)制，為臨床上研究CK

14、D患者并發(fā)心、腦血管病的發(fā)病機(jī)制及預(yù)防提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。
　　 方法：CKD患者10例(GFR均<60ml/min)，均未開(kāi)始血液透析治療抽取靜脈血。分離培養(yǎng)單核細(xì)胞，采用不同濃度(10、50、100μmol/L、500μmol/L)Hcy的RPMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞同時(shí)設(shè)陰性(PBS)對(duì)照，其中100μmol/LHcy組分別在0.5h、1h、2h、3h、4h檢測(cè)各指標(biāo)，其余各組在4h檢測(cè)各指標(biāo)。PDTC組在加500μ

15、mol/LHcy前先給予100mmol/LPDTC處理細(xì)胞。采用雙夾心ELISA法檢測(cè)產(chǎn)生的TFAg，一期凝固法測(cè)得PCA，并用RT-PCR方法檢測(cè)Mo TFmRNA表達(dá)水平，Western blot方法檢測(cè)NF-кBp65蛋白表達(dá)情況，觀察不同濃度Hcy對(duì)單核細(xì)胞TFAg、PCA、NF-кBp65蛋白的影響，以及PDTC對(duì)其干預(yù)作用。
　　 結(jié)果：1)CKD患者外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)，如不加Hcy誘導(dǎo)，其上清液中TF含量極低，與正

16、常人體內(nèi)血漿TF含量相差無(wú)幾。外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)中添加不同濃度Hcy可發(fā)現(xiàn)上清液中TF含量明顯增高，隨著Hcy濃度的增加，TF在CKD患者外周血單核細(xì)胞的表達(dá)水平逐步增高，且呈劑量依賴性(P<0.05)。100μmol/LHcy作用0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h TFAg分別為92.6±18.7、109.1±27.3、110.3±20.7、290.0±17.5、341.8±35.8pg/ml，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

17、5)，表明Hcy誘導(dǎo)TFAg的生成呈時(shí)間依賴性(P<0.05)。
　　 2)檢測(cè)各組Mo的PCA結(jié)果顯示，與靜息細(xì)胞比較，Hcy干預(yù)的Mo的PCA顯著增加，且呈劑量依賴性(P<0.05)，100μmol/L Hcy作用0.5h、1h，PCA與靜息細(xì)胞基本相同，而在2h、3h、4h PCA分別為17.15±1.93、31.75±2.66、37.29±3.62mU，有時(shí)間依賴性(P<0.05)。
　　 3)結(jié)果表明隨著Hcy

18、濃度的增高，TF表達(dá)相應(yīng)增加，500μmol幾Hcy作用4小時(shí)達(dá)高峰(P<0.05)；結(jié)果還顯示100μmol/L Hcy作用0.5h、1h無(wú)表達(dá)，2h、3 h、4 h Mo TFmRNA逐漸升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明Hcy呈濃度和時(shí)間依賴性誘導(dǎo)Mo組織因子mRNA表達(dá)(P<0.05)。
　　 4)Hcy可誘導(dǎo)單核細(xì)胞TFmRNA表達(dá)及TFAg的生成，并具有凝血活性，其作用高峰期在4h。Hcy同時(shí)可增加單核

19、細(xì)胞NF-кBp65蛋白表達(dá)，高峰期在1h，至第2h、4hNF-к Bp65蛋白表達(dá)逐漸減弱。但如果在給予Hcy刺激前先給予100mmol/LNF-к B的抑制劑PDTC，則可見(jiàn)TFmRNA和TFAg、PCA及NF-к B p65的蛋白表達(dá)明顯降低，與Hcy組相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Hcy+PDTC組的NF-кB p65的蛋白表達(dá)甚至與對(duì)照組相似。PDTC對(duì)Hcy誘導(dǎo)的TFmRNA抑制作用在2h左右達(dá)高峰，隨后抑制作