納秒脈沖治療裸鼠惡性黑色素瘤的療效觀察.pdf

1、目的:
　　 評(píng)估納秒級(jí)電脈沖治療綠色熒光蛋白標(biāo)記的惡性黑色素瘤細(xì)胞(A375-GFP)裸鼠皮下移植瘤的療效。
　　 方法:
　　 通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將帶有GFP基因的慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染人惡性黑色素瘤A375細(xì)胞。熒光顯微鏡下篩選轉(zhuǎn)染率達(dá)100％且熒光信號(hào)穩(wěn)定的復(fù)感染指數(shù)(multiplicity of infection，MOI)，建立穩(wěn)定A375-GFP細(xì)胞株，設(shè)為轉(zhuǎn)染組細(xì)胞A375-GFP。同時(shí)設(shè)立未轉(zhuǎn)染組親代細(xì)

2、胞A375。通過四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法及倍增時(shí)間檢測(cè)兩組細(xì)胞增殖能力的改變，流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)細(xì)胞周期分布的差異。建立裸鼠A375-GFP細(xì)胞皮下移植瘤模型，隨機(jī)分為治療組（n=6）和對(duì)照組(n=6)。納秒脈沖電場(chǎng)（脈寬200ns、場(chǎng)強(qiáng)20kV/cm、頻率5Hz，2000個(gè)脈沖，4個(gè)方位，每隔2d治療1次，共2次）治療裸鼠皮下瘤;采用活體熒光成像技術(shù)檢測(cè)裸鼠皮下瘤治療前、治療后48h、10d皮下瘤熒光變化;組織HE染色觀察評(píng)估治療后90

3、d局部效果;數(shù)碼相機(jī)觀察隨訪治療后局部疤痕變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)GFP的A375-GFP細(xì)胞。
　　 2.通過MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)72h時(shí)OD值發(fā)現(xiàn)A375(1.066±0.514)及A375-GFP組細(xì)胞(1.023±0.810)比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。A375-GFP細(xì)胞的倍增時(shí)間(28.9±1.51)h與A375細(xì)胞(29.04±1.04)h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞

4、0.05)。流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)示兩組細(xì)胞周期分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3.穩(wěn)定建立了可視化裸鼠皮下A375-GFP細(xì)胞移植瘤模型。
　　 4.納秒脈沖治療裸鼠皮下移植瘤后，活體熒光成像儀檢測(cè)示治療組皮下移植瘤熒光強(qiáng)度及面積于治療后48h大部分減少，至治療后10d完全消失;對(duì)照組則逐漸增加，治療組與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1055.11，P＜0.0001)。nsPEF治療后90d組織HE染色結(jié)果

5、證實(shí)治療組所有裸鼠皮下移植瘤完全消失。皮下移植瘤經(jīng)nsPEF治療后3-4d，治療局部區(qū)域出現(xiàn)結(jié)痂，于2周內(nèi)脫落，隨時(shí)間推移，局部疤痕逐漸變淺，且肉眼未見原位新生瘤體。
　　 結(jié)論:
　　 1.通過慢病毒轉(zhuǎn)染可以獲得穩(wěn)定，高效且長(zhǎng)期表達(dá)GFP的人黑色素瘤株A375細(xì)胞。
　　 2.慢病毒轉(zhuǎn)染的GFP對(duì)A375細(xì)胞的增殖能力未見明顯影響，可反映親代細(xì)胞的增殖能力，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 3.成功構(gòu)建了