蘋果MdBTs與MdEIL1互作調(diào)控葉片衰老的研究.pdf

1、在擬南芥中，EIN3/EILs轉(zhuǎn)錄因子是一類典型的轉(zhuǎn)錄因子，通過結(jié)合到乙烯信號傳導(dǎo)途徑的下游基因的啟動子上，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄，完成乙烯信號響應(yīng)。同時(shí)，它也可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控其他途徑基因的啟動子，從而調(diào)控植物生長和發(fā)育。本研究中，以蘋果‘嘎拉’（Malus× domestic‘Royal Gala’）為試材，分離了乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的MdEIL1基因（基因序列號：MDP0000423881）。序列分析表明，該基因包含1980 bp完整的開

2、放閱讀框，編碼658個(gè)氨基酸的蛋白。進(jìn)化樹分析表明MdEIL1屬于EIN3/EIL轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白，與白梨（ XP_009341360.1）、枇杷（ ACM89299.1）、碧桃（ABK35086.1）、梅（XP_008231880.1）、川桑（XP_010106128.1）、葡萄（XP_002276380.1）的同源性較高。接著，我們利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在蘋果中，共包括12個(gè)MdEILs，根據(jù)它們處于染色體上的位置和基因特點(diǎn)，分別命

3、名為MdEIL1、MdEIL02、MdEIL03、MdEIL04、MdEIL05、MdEIL06、MdEIL07、MdEIL08、MdEIL09、MdEIL10、MdEIL11、MdEIL12。
　　基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)基因家族成員之間外顯子的數(shù)量不同， MdEIL1、MdEIL02、MdEIL03、MdEIL06、MdEIL09、MdEIL11、MdEIL12只含有1個(gè)外顯子，MdEIL104、MdEIL05、 MdEIL07、Md

4、EIL08、MdEIL10含有2個(gè)外顯子。MdEILs的同源性分析表明，EILs廣泛存在高等植物中，單子葉植物、雙子葉植物、苔蘚植物和蕨類植物中都有EILs基因的存在，但是綠藻中不存在該類基因。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，MdEILs在蘋果的根、莖、葉、花和果實(shí)中有不同程度的表達(dá)，在葉片中的表達(dá)量一般高于其他組織。說明MdEILs的表達(dá)模式呈組成性表達(dá)，且具有一定的組織差異性。qRT-PCR分析還發(fā)現(xiàn)，在葉片不同的發(fā)育時(shí)期， MdEILs的

5、表達(dá)量呈規(guī)律性變化。暗示MdEILs可能參與葉片的衰老過程。MdEIL1過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因愈傷中，衰老相關(guān)基因（SAGs）的表達(dá)量升高。擬南芥中異位表達(dá)MdEIL1，葉片表現(xiàn)為早衰的表型。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MdEIL1能夠直接結(jié)合到miR164、ORE1、NYC1、NYE1和PAO基因啟動子，促進(jìn)擬南芥葉片提早衰老。
　　EIN3/EILs的作為植物中一類轉(zhuǎn)錄因子，不僅可以綁定到不同的下游基因啟動子上調(diào)控基因的表達(dá)，而且可以通過與不同植

6、物蛋白互作，調(diào)控自身或其他蛋白的功能，進(jìn)而調(diào)控植物的生長發(fā)育和逆境響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)室以 MdBT2為誘餌進(jìn)行酵母雙雜篩庫發(fā)現(xiàn)MdEIL1是MdBT2的一個(gè)互作蛋白。我們進(jìn)一步通過酵母雙雜交、pull-down和Co-IP的實(shí)驗(yàn)證明了MdEIL1和MdBT1、MdBT2的蛋白互作，并且MdBT1/2的TAZ結(jié)構(gòu)域和MdEIL1的C末端區(qū)域是兩者互作所必需的。利用體外降解實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了MdBT2負(fù)調(diào)控MdEIL1蛋白積累水平，加入26S蛋白酶體抑制