多肽信號(hào)編碼基因CLE14調(diào)控?cái)M南芥葉片衰老的功能研究.pdf

1、CLE（CLAVATA3/ENDOSPERM SURROUNDING REGION）基因家族編碼的多肽，作為一種植物激素，通過(guò)配體-受體信號(hào)途徑在調(diào)節(jié)植物分生組織的細(xì)胞分裂和分化中起著重要作用。已有的研究證實(shí)，CLE家族基因控制植物根、莖、花等器官的生長(zhǎng)發(fā)育和分生組織干細(xì)胞的分裂分化。擬南芥中的32個(gè)CLE基因，除了CLV3，CLE8，CLE40，CLE41和CLE45等少數(shù)幾個(gè)，大多數(shù)的CLE基因功能依然未知。本研究采用反向遺傳學(xué)方法

2、，對(duì)獲得的兩個(gè)擬南芥CLE14基因的T-DNA插入突變體進(jìn)行表型觀察和分析，結(jié)合基因的表達(dá)模式分析，基因的過(guò)表達(dá)和互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，對(duì)擬南芥CLE14基因的功能進(jìn)行了研究，同時(shí)利用TALEN技術(shù)創(chuàng)制基因敲除的cle14突變體，對(duì)CLE14的功能研究作進(jìn)一步的補(bǔ)充和完善。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)通過(guò)RT-PCR和qRT-PCR分析了CLE14基因在幼葉、成熟葉片、早衰葉片和晚衰葉片中的表達(dá)水平，結(jié)果表明CLE14在未衰老和衰老初期的葉

3、片中表達(dá)量很低，在葉片衰老晚期表達(dá)量急劇增加，分別比成熟時(shí)期和早衰時(shí)期提高了7.1和4.1倍;通過(guò)GUS組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)CLE14基因在葉片的衰老部位，特別是衰老程度較高的部位表達(dá)更為活躍。CLE14的表達(dá)模式分析實(shí)驗(yàn)表明擬南芥CLE14在葉片的衰老過(guò)程中表達(dá)上調(diào)，可能參與葉片衰老的調(diào)控。
　　(2)通過(guò)PCR鑒定獲得的兩個(gè)CLE14的T-DNA插入純合突變體株系，蓮座葉都比野生型更早地變黃衰老，而T-DNA插入位置更靠近編

4、碼區(qū)的cle14-c株系的這種表型更為明顯。RT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示，兩個(gè)clel4突變體株系中的CLE14并非完全被敲除，都還存在少量的表達(dá)。對(duì)cle14-c突變體和野生型蓮座葉進(jìn)行葉綠素含量、Fv/Fm、離子滲漏等指標(biāo)的測(cè)定。數(shù)據(jù)顯示，突變體葉片葉綠素含量平均為0.336 mg/g，顯著低于野生型的0.543 mg/g;在同一葉位，cle14突變體的Fv/Fm總體上都低于野生型，而離子滲漏率總體上都高于野生型，中部葉的差異更為顯著。以上

5、實(shí)驗(yàn)表明，擬南芥CLE14的缺失會(huì)造成葉片的提前衰老。
　　(3)通過(guò)對(duì)CLE14過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行表型觀察，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)植株的葉片比野生型更晚變黃衰老。對(duì)CLE14過(guò)表達(dá)和野生型蓮座葉進(jìn)行葉綠素含量、Fv/Fm、離子滲漏等指標(biāo)的測(cè)定，數(shù)據(jù)顯示，過(guò)表達(dá)植株葉片的葉綠素含量平均為0.743mg/g，顯著高于野生型的0.568 mg/g;在同一葉位，過(guò)表達(dá)植株的Fv/Fm總體上都高于野生型，而離子滲漏率總體上都低于野生型。使用CLE

6、14多肽處理離體擬南芥葉片，與CLE14過(guò)表達(dá)的表型類似，葉片的衰老得到了一定程度的延緩。以上實(shí)驗(yàn)表明，擬南芥CLE14的過(guò)量表達(dá)，會(huì)推遲葉片的衰老。
　　(4)將構(gòu)建的以CLE14自身啟動(dòng)子啟動(dòng)基因表達(dá)的載體ProCLE14∷CLE14，轉(zhuǎn)入cle14突變體進(jìn)行互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入CLE14后，cle14突變體的早衰表型恢復(fù)到了正常的野生型表型?；パa(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，cle14突變體中CLE14的表達(dá)缺失是造成葉片早衰表型的唯一因素。