條件性基因敲除方法研究內(nèi)源性BMP2在小鼠骨折愈合中的生物學(xué)作用.pdf

1、第一章優(yōu)化小鼠骨折模型的建立、評(píng)價(jià)及骨折愈合特點(diǎn)分析
　　 目的:探討優(yōu)化小鼠骨折模型的建立，并對其效果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)分析，初步研究兩種改良的小鼠骨折模型的骨折愈合特點(diǎn)。
　　 方法:在無菌操作下對C57BL/6野生型小鼠行單側(cè)開放性脛骨骨干橫形骨折髓內(nèi)針固定術(shù)或單側(cè)閉合性股骨骨干橫形骨折髓內(nèi)針固定術(shù)。術(shù)后連續(xù)觀察小鼠35天，通過在術(shù)后第4、7、10、14、21、28天、35天收取骨折部位標(biāo)本進(jìn)行X線、micro-CT、組

2、織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析，并連續(xù)觀察小鼠平均體重值、活動(dòng)能力及步態(tài)變化，將上述兩種骨折模型效果及愈合特點(diǎn)進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果:
　　 1.開放性脛骨骨干橫形骨折模型單批建立成功率為94.2％，閉合性股骨骨干橫形骨折模型單批建立成功率為80.0％。術(shù)后第14天及28天，骨折線模糊程度在脛骨骨折組小鼠和股骨骨折組小鼠之間有顯著差異(p＜0.05)。
　　 2.脛骨骨折組小鼠骨性骨痂體積百分比及骨連接密度在術(shù)后第10、14、

3、21及28天均顯著高于股骨骨折組小鼠(p＜0.05)。
　　 3.術(shù)后第7天，脛骨骨折組小鼠軟骨骨痂面積百分比顯著高于股骨骨折組小鼠;術(shù)后第10、14、21、28天，脛骨骨折組小鼠骨性骨痂面積百分比顯著高于股骨骨折組小鼠(p＜0.05)。
　　 4.脛骨骨折組小鼠和股骨骨折組小鼠的軟骨骨痂面積百分比分別在術(shù)后第7天和第10天到達(dá)峰值。
　　 5.術(shù)后脛骨骨折組小鼠在體重、活動(dòng)能力及步態(tài)恢復(fù)均快于股骨骨折組小鼠。<

4、br>　　 結(jié)論:改良的小鼠開放性脛骨骨干橫形骨折髓內(nèi)針固定模型是一種較為理想的小鼠骨折模型。
　　 第二章細(xì)胞特異性Bmp2條件性基因敲除小鼠骨骼生理特點(diǎn)研究
　　 目的:評(píng)估成骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞特異性Bmp2基因敲除小鼠作為骨折愈合相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究動(dòng)物平臺(tái)的可行性及可靠性。
　　 方法:通過將Col1a1-Cre;Bmp2fx、fx或Col2a1-Cre;Bmp2fx/fx與Bmp2fx/fx小鼠交配獲得成骨細(xì)胞

5、或軟骨細(xì)胞特異性Bmp2基因敲除小鼠。通過收取多部位骨組織標(biāo)本進(jìn)行X線、micro-CT、組織形態(tài)計(jì)量學(xué)及mRNA表達(dá)分析，并連續(xù)觀察小鼠平均體重值，將上述兩種小鼠與Cre陰性對照組小鼠在2周齡、1月齡及2月齡進(jìn)行骨相關(guān)生理學(xué)特點(diǎn)比較。
　　 結(jié)果:
　　 1.2周齡時(shí)，軟骨細(xì)胞特異性Bmp2條件性基因敲除小鼠平均體重值顯著低于其它兩組小鼠(p＜0.05)。
　　 2.成骨細(xì)胞特異性Bmp2條件性基因敲除小鼠在各

6、時(shí)間點(diǎn)均出現(xiàn)短尾卷曲畸形，而軟骨細(xì)胞特異性Bmp2條件性基因敲除小鼠體型在2周齡時(shí)顯著小于Cre陰性對照組小鼠。
　　 3.2周齡及1月齡時(shí)，軟骨細(xì)胞特異性條件性Bmp2基因敲除小鼠在骨量及骨密度均顯著低于Cre陰性對照組小鼠(p＜0.05)，而在2月齡時(shí)僅稍低于對照組小鼠。
　　 4.三組小鼠骨標(biāo)本在組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析與Cre陰性對照組小鼠未見顯著差異。
　　 5.肋軟骨組織中，Sox9在軟骨細(xì)胞特異性Bmp2

7、條件性基因敲除小鼠2周齡時(shí)較Cre陰性對照組小鼠顯著增高， Col2a1及ColX的表達(dá)水平則顯著低于Cre陰性對照組小鼠(p＜0.05)。
　　 結(jié)論:各組小鼠在2月齡時(shí)的骨生理學(xué)特征已非常相似，具有進(jìn)行骨折相關(guān)研究的可行性及可靠性。
　　 第三章內(nèi)源性BMP2在小鼠骨折愈合中的生物學(xué)作用
　　 目的:研究小鼠骨折愈合過程內(nèi)源性BMP2在軟骨性骨痂或骨性骨痂中的生物學(xué)作用及其發(fā)揮作用的具體細(xì)胞群與時(shí)相。

8、　　 方法:通過以成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞特異性Bmp2基因敲除小鼠及Cre陰性對照組小鼠為平臺(tái)，建立開放性脛骨骨干橫形骨折髓內(nèi)針固定模型。通過在術(shù)后第7、10、14、21、28天收取骨折部位標(biāo)本進(jìn)行X線、micro-CT、組織形態(tài)計(jì)量學(xué)、生物扭力學(xué)及骨痂mRNA表達(dá)分析，將上述三組小鼠的骨折愈合特點(diǎn)進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果:
　　 1.術(shù)后第14天及28天，骨折線模糊程度在軟骨細(xì)胞特異性Bmp2基因敲除小鼠與Cre陰性對照組

9、小鼠之間有顯著差異。
　　 2.軟骨細(xì)胞特異性Bmp2基因敲除小鼠骨性骨痂體積百分比及骨連接密度在術(shù)后第7、10、14、21天較Cre陰性對照組小鼠均顯著降低(p＜0.05)。
　　 3.術(shù)后第10、14、21天，軟骨細(xì)胞特異性Bmp2基因敲除小鼠軟骨骨痂面積百分比顯著大于Cre陰性對照組小鼠，骨性骨痂面積百分比則顯著小于Cre陰性對照組小鼠(p＜0.05)。
　　 4.在術(shù)后第10、14、21天，軟骨細(xì)胞特異性