V-ATPase的B2亞基在TGF-β致腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討TGF—β作用大鼠近端小管上皮細(xì)胞株(NRK—52E)不同時(shí)間，α—SMA及E—Cadherin表達(dá)情況；探討V—ATPase B亞基在TGF—β1致腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中表達(dá)的變化。 方法：無(wú)血清培養(yǎng)NRK—52E細(xì)胞株16h—24h后，分別用TGF—β1(10ng/ml)刺激0h(正常對(duì)照組)、6h、12h、24h、48h、72h，用RT—PCR及Western Blot分別檢測(cè)不同時(shí)間E—Cadherin及α—S

2、MA mRNA和蛋白水平的表達(dá)。用細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)細(xì)胞E—Cadherin及α—SMA表達(dá)及分布的變化；無(wú)血清培養(yǎng)NRK—52E細(xì)胞株16h—24h后，分別用TGF—β1(10ng/ml)刺激0h(正常對(duì)照組)、6h、12h、24h、48h、72h，用RT—PCR和Western Blot檢測(cè)V—ATPase的B1、B2亞基mRNA和蛋白水平的變化。 結(jié)果：①RT—PCR和Western blot結(jié)果顯示，TGF—β1(10

3、ng/ml)刺激后E—cadherin mRNA及蛋白水平的表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低，且在刺激24h時(shí)表達(dá)已明顯減弱(E—Cadherin/GAPDH: PCR擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)比值1.30±0.15 vs1.91±0.18；蛋白半定量比值3.21±0.24 vs3.76±0.15,24h vs0h，p<0.05)。免疫熒光結(jié)果也顯示，正常對(duì)照組E—Cadherin在細(xì)胞膜表達(dá)完整，TGF—β1刺激組E—cadherin的表達(dá)明顯降低。②RT

4、—PCR和Western blot結(jié)果顯示，TGF—β1(10ng/ml)刺激NRK—52E后，α—SMA mRNA和蛋白表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，呈時(shí)間依賴(lài)性，且在刺激24h時(shí)表達(dá)明顯增強(qiáng)(α—SMA/GAPDH： PCR擴(kuò)增產(chǎn)物相對(duì)比值1.05±0.16 vs0.57±0.19；蛋白半定量比值1.01±0.30 vs0.52±0.15，24h vs0h，p<0.05)。免疫熒光結(jié)果也顯示，正常對(duì)照組α—SMA幾乎看不到，TGF—β1

5、刺激后胞漿內(nèi)α—SMA的綠色陽(yáng)性信號(hào)明顯增加。③RT—PCR結(jié)果顯示，TGF—β1刺激24h后，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染V—ATPase B2質(zhì)粒24小時(shí)，NRK52E細(xì)胞V—ATPase B2亞基表達(dá)顯著增加，表達(dá)量約為刺激組2.8倍。但抑制劑組和刺激組B2亞基的表達(dá)無(wú)顯著差異。V—ATPase B2轉(zhuǎn)染組TGF—β1(10ng/ml)刺激后α—SMA mRNA的表達(dá)顯著降低(40.30％，p<0.05)，E—Cadherin mRNA的表達(dá)增加(1

6、.34倍，p<0.05)；而抑制劑組TGF—β1刺激后α—SMA表達(dá)增加(18.31％，p<0.05)，同時(shí)E—Cadherin表達(dá)降低(51.36％，p<0.05)的表達(dá)。 結(jié)論：TGF—β1在誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程中，V—ATPase B2亞基的表達(dá)先增高后降低，而B(niǎo)1亞基不受影響；過(guò)表達(dá)V—ATPase B2亞基可能抑制TGF—β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，而V—ATPase特異性抑制劑Bafilomycin