多氯聯(lián)苯對小鼠附睪的毒性效應及機制的研究.pdf

1、多氯聯(lián)苯(Polychlorinatedbiphenyls，PCBs)是最難以降解的持久性有機污染物之一。有關(guān)PCB的生殖毒性效應及機制已開展了較多的研究，但PCB對附睪的毒性效應及機制還不清楚。本研究以C57BL/6品系青春期雄性小鼠為研究對象，以商品化的Aroclor1254為PCB代表，研究環(huán)境水平的PCB暴露(0.5、5、50和500μg/kg)對附睪的毒性效應及機制。
　　 青春期雄性小鼠在Aroclor1254暴露5

2、0天后，其體重、睪丸和附睪重量沒有顯著性變化，精子密度、精子活力以及頂體酶活性呈現(xiàn)劑量依賴性下降，精子畸形率呈現(xiàn)劑量依賴性上升。血清中的雌激素水平表現(xiàn)出劑量依賴性的下降，雄激素的水平?jīng)]有表現(xiàn)出顯著性的變化。Westernblot檢測的結(jié)果顯示：附睪中的雌激素受體α(Estrogenreceptorα，ERα)和雌激素受體β(Estrogenreceptorβ，ERα)并無顯著性變化，而雄激素受體在500μg/kg組表現(xiàn)出顯著性下降，提示

3、Aroclor1254對附睪表現(xiàn)出抗雄激素效應。
　　 利用cDNA微陣列(Microarray)技術(shù)研究附睪頭部在低濃度(5μg/kg)和高濃度(500μg/kg)Aroclor1254暴露下基因的差異表達，結(jié)果顯示：共篩選出2350個差異表達基因，其中低濃度組引起附睪頭部572個基因的差異表達，包括上調(diào)基因212個，下調(diào)基因360個；高濃度組引起附睪頭部1769個基因的差異表達，其中上調(diào)基因433個，下調(diào)基因1336個。應用

4、實時熒光定量PCR(Real-timefluorescentquantitativePCR，Real-timePCR)對部分差異表達基因進行了mRNA水平的驗證，結(jié)果證明了芯片檢測的可靠性。進一步應用分子注釋系統(tǒng)（MoleculeAnnotationSystem，MAS），結(jié)合功能注釋聚類(FunctionalAnnotationClustering)以及聚類分析(Clustering)等生物信息技術(shù)，對差異表達基因信息和功能以及所參與

5、的信號通路進行挖掘和注釋，得到差異基因中最為顯著的功能類別和信號通路，其中涵蓋了GTP結(jié)合、核小體組裝、能量代謝、RNA加工等方面。為進一步探索PCB對附睪的毒性效應機制提供了依據(jù)。
　　 根據(jù)功能注釋聚類的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)與GTP結(jié)合相關(guān)的基因在高濃度Aroclor1254暴露后表現(xiàn)出最高的富集度(Enrichmentscore)，表明相關(guān)基因的表達變化是Aroclor1254暴露作用于附睪表達譜的最顯著的效應之一。MAS分析表明相

6、關(guān)基因的功能包括了緊密連接和肌動蛋白細胞骨架的調(diào)控。Westernblot檢測表明相關(guān)的小GTP結(jié)合蛋白，如K-ras、CdeA2以及RhoA等的表達水平在PCB暴露后表現(xiàn)出顯著性的下調(diào)。小GTP結(jié)合蛋白通過調(diào)節(jié)肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈(Myosinregulatorylightchain，MRLC)和絲切蛋白(Cofilin)的磷酸化水平來調(diào)節(jié)緊張纖維的收縮和肌動蛋白聚合的穩(wěn)定性。Westernblot結(jié)果表明MRLC磷酸化水平上升而Cofi

7、lin磷酸化水平下降，提示緊張纖維的收縮加強、肌動蛋白聚合的穩(wěn)定性增加。
　　 小GTP結(jié)合蛋白表達的變化和纖維的收縮加強提示緊密連接功能的改變。Westemblot結(jié)果表明緊密連接的組成蛋白（胞質(zhì)緊密粘連蛋白1）ZO-I在500μg/kgPCB暴露下表現(xiàn)出顯著性的下調(diào)。免疫組化結(jié)果表明定位與細胞頂端連接的ZO-1染色并沒有明顯的變化。免疫共沉淀的結(jié)果表明，Occludin的酪氨酸磷酸化的水平上升。電鏡下的硝酸鑭示蹤提示緊密連接

8、的透過性增加。緊密連接的透過性關(guān)系到精子成熟環(huán)境的維持，PCB暴露對緊密連接的影響提示了PCB對生殖毒性的新機制。
　　 對低濃度和高濃度都能夠顯著性誘導的差異基因進行基因分類學注釋(GeneOntology，GO)，選取GO注釋包括細胞外空間（Extracelluarspace或Extracelluarregion）為候選標志物。從中選取鞘脂激活蛋白原(Prosaposin，Psap)進行蛋白表達水平的驗證。將Psap表達水平