阿霉素與蘇尼替尼引起的心臟毒性及ZMY對(duì)其保護(hù)作用的機(jī)制研究.pdf

1、一.研究目的:(1)探討ZMY對(duì)阿霉素引起的大鼠原代心肌細(xì)胞毒性的保護(hù)作用、ZMY對(duì)阿霉素引起的小鼠心臟毒性的保護(hù)作用,以及ZMY對(duì)阿霉素心臟毒性保護(hù)作用的分子機(jī)制。(2)探討蘇尼替尼引起的大鼠H9c2心肌細(xì)胞毒性作用,并探索ZMY對(duì)蘇尼替尼引起的心肌細(xì)胞毒性的保護(hù)作用機(jī)制。
　　 二.研究方法:
　　 1.ZMY抗氧化活性及抗腫瘤活性作用研究:(1)DPPH法測(cè)定ZMY體外抗氧化活性研究;(2)MTT法測(cè)定ZMY與阿霉

2、素合用對(duì)K562、NB4、U937白血病細(xì)胞的協(xié)同抑制作用;(3)建立U937裸小鼠移植瘤模型評(píng)價(jià)ZMY與阿霉素合用的體內(nèi)抗腫瘤活性。
　　 2.ZMY對(duì)阿霉素引起的大鼠原代心肌細(xì)胞毒性的保護(hù)作用及其機(jī)制研究包括:(1)MTT法測(cè)定阿霉素及合用ZMY對(duì)大鼠原代心肌細(xì)胞的抑制作用;(2)全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定阿霉素及合用ZMY后大鼠原代心肌細(xì)胞上清心肌酶譜的變化;(3)DCF法測(cè)定阿霉素及合用ZMY后大鼠原代心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS

3、)生成水平變化;(4)DAPI染色法檢測(cè)阿霉素及合用ZMY后大鼠原代心肌細(xì)胞的凋亡情況;(5)JC-1法測(cè)定阿霉素及合用ZMY后大鼠原代心肌細(xì)胞線粒體膜電位的變化;(6)Western-blot檢測(cè)阿霉素及合用ZMY后大鼠原代心肌細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白的變化。
　　 3.ZMY對(duì)阿霉素引起的小鼠心臟毒性的保護(hù)作用研究:(1)建立ICR小鼠阿霉素心臟毒性模型,觀察合用ZMY后小鼠體重的變化;(2)觀察合用ZMY后小鼠存活率的變化;(3)觀

4、察合用ZMY后小鼠血清心肌酶譜的變化。
　　 4.蘇尼替尼引起的大鼠H9c2心肌細(xì)胞毒性作用及其機(jī)制研究包括:(1)MTI法測(cè)定蘇尼替尼對(duì)H9c2細(xì)胞的抑制作用,計(jì)算IC50值;(2)DAPI染色法檢測(cè)蘇尼替尼作用后H9c2細(xì)胞的凋亡情況;(3)AO染色法檢測(cè)蘇尼替尼作用后H9c2細(xì)胞內(nèi)酸性白噬泡生成情況;(4)轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒檢測(cè)蘇尼替尼作用后H9c2細(xì)胞內(nèi)自噬泡生成情況。(5)Western-blot檢測(cè)蘇尼替尼作用后

5、H9c2細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白和自噬蛋白的變化;(6)siRNA法沉默Beclin1基因的表達(dá),抑制細(xì)胞自噬的水平,MTT法測(cè)定蘇尼替尼作用后細(xì)胞存活率的變化;
　　 5.ZMY對(duì)蘇尼替尼引起的大鼠H9c2心肌細(xì)胞毒性的保護(hù)作用及其機(jī)制研究包括:(1)MTT法測(cè)定蘇尼替尼及合用ZMY對(duì)H9c2細(xì)胞的抑制作用的變化;(2)DCF法測(cè)定蘇尼替尼及合用ZMY對(duì)H9c2細(xì)胞內(nèi)活性氧生成水平變化;(4)AO染色法檢測(cè)蘇尼替尼及合用ZMY后H9c2

6、細(xì)胞自噬情況的變化;(5)Western-blot檢測(cè)蘇尼替尼及合用ZMY后H9c2細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白的變化。
　　 三.研究結(jié)果:
　　 1.ZMY具有很強(qiáng)的抗氧化活性并能協(xié)同增強(qiáng)阿霉素的體內(nèi)外抗腫瘤活性:(1)ZMY具有良好的DPPH自由基清除作用,其自由基清除能力超過維生素C;(2)ZMY與阿霉素合用對(duì)三種白血病細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的體外協(xié)同抑制作用;(3)在U937裸小鼠移植瘤模型中,給藥6天后,ADR2mg/kg、Z

7、MY500mg/kg和合用組腫瘤抑瘤率(％)分別為14.5、18.0和57.1,T/C(%)值分別為69.4、73.5和41.3.結(jié)果證實(shí)ADR2mg/kg和ZMY500mg/kg合用時(shí)可以顯著抑制U937腫瘤的生長(zhǎng),具有很好的協(xié)同抗腫瘤效果。
　　 2.ZMY通過其抗氧化活性對(duì)阿霉素引起的大鼠原代心肌細(xì)胞毒性的保護(hù)作用及機(jī)制:(1)ZMY對(duì)阿霉素引起的大鼠原代心肌細(xì)胞毒性作用表現(xiàn)出較強(qiáng)保護(hù)作用,阿霉素作用24h后阿霉素2μM單

8、用組和50μMZMY預(yù)處理組細(xì)胞抑制率分別為30.7%、14.5%;(2)心肌酶譜檢測(cè)結(jié)果顯示ZMY預(yù)處理組細(xì)胞比阿霉素單用組AST、LDH、CKMB值顯著下降;(3)作用3h后阿霉素2μM單用組ROS的生成為241.5%,50μMZMY預(yù)處理組細(xì)胞阿霉素作用3h后,ROS生成為80.0%,與阿霉素單用組相比ROS的水平顯著降低;(4)DAPI染色發(fā)現(xiàn),合用ZMY后阿霉素引起的大鼠原代心肌細(xì)胞的凋亡率隨之降低;(5)合用ZMY后可以逆轉(zhuǎn)

9、阿霉素引起的大鼠原代心肌細(xì)胞線粒體膜電位的降低;(6)Western-blot結(jié)果顯示,ZMY可以通過抑制ERK,進(jìn)而抑制P53激活來減少阿霉素引起的心肌細(xì)胞凋亡,同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ZMY還可以通過抑制JNK,P38激活,抑制凋亡.
　　 3.ZMY表現(xiàn)出很強(qiáng)的體內(nèi)心臟毒性的保護(hù)作用:(1)在ICR小鼠阿霉素心臟毒性模型中,合用ZMY后小鼠體重下降比阿霉素單用組明顯變慢;(2)阿霉素給藥6天后,500mg/kgZMY合用組ICR小

10、鼠存活率為84.62%,阿霉素單用組為7.69%,結(jié)果證實(shí)ZMY和阿霉素合用時(shí)可以顯著提高ICR小鼠存活率;(3)阿霉素單用組血清AST值為578±84IU/L,與合用ZMY500mg/kg組值276±102IU/L有顯著差異;阿霉素單用組LDH值為1603±303IU/L,與合用ZMY500mg/kg組值293±199IU/L有顯著差異;阿霉素單用組CKMB值為922±120IU/L,與合用ZMY500mg/kg組值248±270IU

11、/L有顯著差異。
　　 4.蘇尼替尼引起的大鼠H9c2心肌細(xì)胞毒性作用與細(xì)胞自噬有密切的關(guān)系:(1)蘇尼替尼對(duì)大鼠H9c2心肌細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用,作用48h后計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50值為6.53μM;(2)DAPI染色發(fā)現(xiàn),隨著蘇尼替尼給藥濃度的升高,H9c2細(xì)胞的死亡率隨之升高,但凋亡現(xiàn)象不明顯;(3)AO染色發(fā)現(xiàn),蘇尼替尼作用后H9c2細(xì)胞內(nèi)酸性自噬泡生成明顯增加;(4)通過轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒發(fā)現(xiàn),蘇尼替尼作用

12、后H9c2細(xì)胞內(nèi)自噬泡生成明顯增加;(5)Western-blot結(jié)果顯示,蘇尼替尼作用后H9c2細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白的表達(dá)沒有明顯的變化,但是細(xì)胞內(nèi)自噬蛋白LC3、Beclin1的表達(dá)與蘇尼替尼存在明顯的濃度依賴性和時(shí)間依賴性關(guān)系;(6)siRNA法沉默Beclin1后,抑制細(xì)胞自噬的水平,與相應(yīng)對(duì)照組相比蘇尼替尼作用后細(xì)胞存活率明顯增加。
　　 5.ZMY對(duì)蘇尼替尼引起的大鼠H9c2心肌細(xì)胞毒性具有比較明顯的體外保護(hù)作用:(1)Z

13、MY對(duì)蘇尼替尼引起的H9c2細(xì)胞的抑制作用表現(xiàn)出明顯保護(hù)作用,作用24h后蘇尼替尼5μM單用組和50μMZMY預(yù)處理組細(xì)胞抑制率分別為28.3%、3.1%;(2)ROS檢測(cè)結(jié)果顯示,蘇尼替尼作用3h后,H9c2細(xì)胞內(nèi)活性氧生成明顯增加,呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性關(guān)系;合用ZMY后,與蘇尼替尼單用組相比ROS生成顯著降低;(3)AO染色發(fā)現(xiàn),合用ZMY后蘇尼替尼弓I起的H9c2細(xì)胞內(nèi)酸性自噬泡的生成明顯減少;(4)Western-blot結(jié)果