基因芯片技術(shù)在慢性髓細(xì)胞性白血病分子機制中的研究.pdf

1、慢性髓細(xì)胞性白血病(Chronicmyeloidleukemia，CML)是血液系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，95％以上的CML臨床病人有Ph染色體，即t(9；22)(q34；q11)，其分子生物學(xué)本質(zhì)是9q34的c-abl基因與22q11的bcr基因重組形成bcr/abl融合基因，其翻譯產(chǎn)生的P210蛋白具有明顯增高的酪氨酸激酶活性，是致病的主要因素。白血病的發(fā)生和發(fā)展是多種相關(guān)基因表達(dá)失?；蛟S多腫瘤抑制基因失活所致。正?；蛲蛔兓蛉笔?、癌基因

2、的異常擴增和表達(dá)以及多個基因的協(xié)同作用、基因本身的多效性和機體免疫因素，決定最終白血病表型的表達(dá)與否。 基因芯片技術(shù)是近年來分子生物學(xué)與微電子學(xué)等多學(xué)科交融而成的、能夠進(jìn)行高通量基因表達(dá)研究的最新手段，已廣泛應(yīng)用于人類基因研究中。主要包括芯片探針的制備、載體介質(zhì)的選擇與表面處理、陣列的打印、樣品標(biāo)記與分子雜交、以及芯片掃描與信息分析等內(nèi)容。 該課題制備了K562細(xì)胞基因表達(dá)譜芯片，并應(yīng)用該自制芯片對藥物誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋

3、亡過程中的基因表達(dá)改變進(jìn)行了研究；同時應(yīng)用ABI公司的人全基因組表達(dá)譜芯片對慢性髓系白血病的發(fā)生機理進(jìn)行了初步探討。 研究內(nèi)容可分為三部分： 1.應(yīng)用限制性顯示PCR技術(shù)構(gòu)建人慢性髓系白血病K562細(xì)胞的cDNA文庫?；虮磉_(dá)譜芯片制作的首要問題是快速獲取大量的cDNA探針。對逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA進(jìn)行限制性分組PCR擴增后，同時采用兩種方法制備K562細(xì)胞cDNA探針。一是將分組PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，應(yīng)用核酸

4、銀染技術(shù)分離、顯示DNA條帶，平均每組有7-10條DNA帶，在日光燈下可以直接切膠回收片段，進(jìn)行二次PCR擴增及純化后作為基因芯片探針。二是將分組PCR產(chǎn)物同T載體連接，構(gòu)建基因片段文庫，共收集800條探針，長度主要集中在（250～750）bp之間，并完成了部分探針的測序，其中包括細(xì)胞周期相關(guān)基因、細(xì)胞代謝途徑相關(guān)基因、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因、腫瘤相關(guān)基因等。 2.探討了酪氨酸激酶抑制劑(STI571)對K562細(xì)胞生長、增

5、殖的影響。該研究觀察到在體外培養(yǎng)的條件下，應(yīng)用1.0μmol/L的STI571處理K562細(xì)胞達(dá)到一定的時間(24h)后，細(xì)胞生長明顯變緩，出現(xiàn)凋亡細(xì)胞的特征：細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)濃集及胞膜起泡，部分細(xì)胞胞膜破裂，在其周圍有致密的凋亡小體出現(xiàn)，DNA電泳出現(xiàn)典型的凋亡“梯狀”帶，證明STI571能有效抑制K562細(xì)胞生長，誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。利用自制的K562細(xì)胞基因表達(dá)譜芯片研究STI571誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡前后的基因表達(dá)差異。雜交檢

6、測后發(fā)現(xiàn)經(jīng)STI571誘導(dǎo)后基因表達(dá)下調(diào)的基因有11個，表達(dá)上調(diào)的基因有3個。對這些表達(dá)變化的基因功能進(jìn)行初步分析后發(fā)現(xiàn)，主要包括細(xì)胞增殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，以及抗凋亡基因。其中p27(Kip1)基因的上調(diào)與以往文獻(xiàn)報道一致。 3.應(yīng)用ABI1700芯片分析系統(tǒng)研究慢性髓細(xì)胞性白血病(CML)的基因表達(dá)的變化。分別從正常人和慢性髓細(xì)胞性白血病(CML)病人骨髓樣品中抽取骨髓單個核細(xì)胞，分離出cDNA片段，然后再反轉(zhuǎn)錄成cRNA