鮑（Haliotis diversicolor supertexta）核轉錄因子Ab-Rel的功能與特性分析及分子檢測方法的建立.pdf

1、Rel/NF-κB是一族重要的轉錄因子蛋白，其參與調控免疫細胞活化、胚胎發(fā)育、應激反應、細胞增殖和凋亡等多種細胞生理活動。研究表明NF-κB過度活化與炎癥、腫瘤、病毒感染等免疫及病理過程有非常密切的關系。在高等哺乳動物，Rel/NF-κB作為免疫信號傳導因子得到了較深入的研究。新藥研發(fā)領域中，NF-κB信號通路也已成為了重要的靶點。本論文包括基礎理論研究和新應用技術研究兩部分。在基礎理論研究方面，最主要創(chuàng)新性成果是(Ⅰ)在國際上第一次克

2、隆了腹足動物九孔鮑H diversicolor supertexta核轉錄因子(Ab-Rel)基因，測定了該基因的全長cDNA核苷酸序列，確定了Ab-Rel與同源蛋白的分子進化關系；(Ⅱ)對Ab-Rel兩個不同功能區(qū)進行了重組表達、蛋白純化、功能分析與抗體制備，通過試驗證明了Ab-Rel與Rel/NF-κB蛋白家族在功能上的相似性，確定了貝類NF-κB蛋白的分子結構模式；(Ⅲ)對Ab-Rel進行了轉錄表達、蛋白活性等功能分析，揭示了貝類

3、NF-κB在免疫反應中的激活機理，用實驗證明了NF-κB信號通路在貝類中的功能保守性：(Ⅳ)利用桿狀病毒．昆蟲細胞表達系統(tǒng)表達了鮑核轉錄因子蛋白，對Ab-Rel在昆蟲細胞中進行了亞細胞定位，并對其核定位信號進行了功能鑒定。所有試驗結果為低等無脊椎動物天然免疫防御系統(tǒng)的研究以及探索NF-κB信號通路的進化起源提供了基礎。在新應用技術研究方面，建立了(Ⅰ)雙抗體間接ELISA和(Ⅱ)磁捕獲等分離檢測NF-κB蛋白的新技術。雙抗體間接ELIS

4、A技術是利用兩個分別針對Rel蛋白不同分子結構域的抗體，對體內NF-κB蛋白進行檢測，該技術要比普通的ELISA靈敏，更適用于檢測表達量較低，如轉錄因子之類的蛋白。我們建立的用于分離NF-κB蛋白的磁捕獲技術是以磁珠-DNA-蛋白質親和為基礎的分離技術，因為只有具有活性的NF-κB才能被磁珠捕獲，所以該技術不僅能用于分離NF-κB，同時還能對其活性進行檢測。磁捕獲NF-κB技術操作簡單，樣品受外力影響小，為研究蛋白互作以及藥物篩選提供了

5、一條新的途徑。 主要結果包括下列部分： 1．鮑核轉錄因子全長cDNA的克隆與序列分析 根據Rel蛋白的結構特征設計了寡聚核苷酸引物，利用3′，5′cDNA未端快速擴增技術(3′，5′RACE)獲得了鮑核轉錄因子(Ab-Rel)的全長cDNA序列。該cDNA全長1943bp，具有一個1752 bp的開放讀碼框，編碼大小為584個氨基酸的蛋白。對Ab-Rel核酸和氨基酸序列進行生物信息學分析，并構建了系統(tǒng)進化樹。結果

6、表明，鮑核轉錄因子Ab-Rel具有Rel蛋白家族的主要特征，如DNA結合基序RGLRFRYECE，核定位信號(nuclear localization signal，NLS)EEKRKR和位于NLS上游25個氨基酸的磷酸化位點RRPS。在以鄰近法構建的系統(tǒng)進化樹中，Ab-Rel與昆蟲Dorsal類Rel蛋白分在同一個亞群中，并都歸屬于羧基端具有轉錄激活域(TD)的Rel蛋白家族。 2．Ab-Rel的原核表達，蛋白活性分析與鮑NF

7、-κB晰結構的鑒定 根據Ab-Rel特殊的蛋白結構分別構建了九孔鮑Ab-Rel的Rel同源區(qū)(RHD)和轉錄激活區(qū)(TD)的原核表達載體，在大腸桿菌中進行高效表達和純化，并制備了對Ab-Rel RHD和TD特異的兩個多克隆抗體。EMSA結果表明重組Ab-Rel RHD蛋白具有特異的DNA結合能力，從蛋白功能上證實了Ab-Rel與其它Rel家族成員的相似性。以獲得的兩個抗體進行Western印跡分析了鮑NF-κB蛋白的分子結構，證

8、實了Ab-Rel是鮑NF-κB蛋白的一個大亞基，進而從分子結構上驗證了NF-κB蛋白在腹足動物．鮑與高等動物之間的相似性。 3．Ab-Rel的表達分析 通過半定量RT-PCR．和Norther雜交試驗檢測不同組織中Ab-Rel mRNA的含量發(fā)現，Ab-Rel在所檢測的組織中均有表達，表現了其功能的多樣性。但在血淋巴細胞中．Ab-Rel轉錄子的含量相對較多，表明Ab-Rel在鮑免疫反應中發(fā)揮積極的作用。 4．Ab

9、-Rel在免疫反應中的功能與機理 半定量RT-PCR、Real-time熒光定量PCR、Norther雜交和EMSA的結果顯示，大腸桿菌脂多糖(LPS)不能刺激鮑血淋巴細胞中Ab-Rel的表達，但可以使血淋巴細胞中NF-κB的DNA結合活性增加，表明鮑核轉錄因子Ab-Rel在免疫反應中具有調節(jié)作用，而其功能的激活發(fā)生在轉錄后。試驗結果證明了NF-κB在鮑免疫反應中的作用，從而表明NF-κB信號通路在腹足類動物中的保守性。

10、 5．Ab-Rel在昆蟲細胞中的表達與亞細胞定位 利用Bac to Bac桿狀病毒．昆蟲細胞表達系統(tǒng)對Ab-Rel基因進行表達，通過與綠色熒光蛋白(EGFP)相融合，對Ab-Rel在昆蟲細胞中進行了亞細胞定位。結果表明，鮑Ab-Rel基因能在昆蟲細胞中獲得表達，EGFP-Ab-Rel的融合蛋白定位于細胞核中。 6．雙抗體間接ELISA檢測鮑NF-κB 利用兩個抗體對鮑NF-κB進行ELISA檢測，與只用一個抗體的

11、間接ELISA方法相比，該技術得利于抗體與抗原間有更多的結合位點，當加入酶標二抗和顯色底物時，反應信號將會成倍放大。這種利用雙抗體與二抗聯用的間接ELISA方法更為靈敏，且操作簡單，省時、省力，尤其適用于檢測如NF-κB這樣表達量較低的細胞因子。以此方法從蛋白水平上證明了Ab-Rel存在于鮑不同組織中，但血淋巴細胞中Ab-Rel蛋白的含量相對較多，進一步說明Ab-Rel蛋白在鮑免疫反應中的作用。 7．磁捕獲技術在NF-κB分離與

12、檢測中的應用 本試驗在上述研究的基礎上提出一種新的磁捕獲技術方案，用于分離和檢測該DNA結合蛋白。通過優(yōu)化實驗條件，我們成功地從鮑血細胞蛋白中分離出了Ab-Rel蛋白。為了進一步證明該方法的實用性，我們對在昆蟲細胞中表達的重組Ab-Rel蛋白進行分離，結果表明磁捕獲技術不僅能有效地分離內源性NF-κB，而且對體外重組的NF-κB蛋白同樣有效。因為只有具DNA結合活性的蛋白才能被捕獲分離，所以磁捕獲技術在分離蛋白的同時，還可以鑒定