小麥ERF轉(zhuǎn)錄因子TaEREB1-2、TaERFL1-2的特性分析及功能鑒定.pdf

1、AP2/EREBP類蛋白是高等植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，含有由60～70個(gè)氨基酸殘基組成的高度保守的AP2/EREBP DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。此結(jié)構(gòu)域包含三個(gè)β折疊和一個(gè)α螺旋，通過與目的基因上游啟動(dòng)子區(qū)域中富含GC的順式作用元件(如GCC盒、DRE元件等)相互作用，參與調(diào)控植物細(xì)胞周期、生長發(fā)育、細(xì)胞增殖、次生代謝、生物和非生物脅迫應(yīng)答及植物激素信號(hào)傳導(dǎo)等多種信號(hào)途徑。其中ERF轉(zhuǎn)錄因子β折疊的第14位和19位分別為丙氨酸和天冬氨酸，與E

2、RE順式作用元件(又稱GCC盒)結(jié)合，主要參與植物內(nèi)源激素乙烯信號(hào)途徑，應(yīng)答多種生物脅迫。但也有些ERF轉(zhuǎn)錄因子還能與DRE順式元件結(jié)合，應(yīng)答多種生物與非生物脅迫。本研究的目的是對(duì)本實(shí)驗(yàn)室已克隆的小麥ERF基因TaEREB1/2、TaERFL1/2進(jìn)行系統(tǒng)的分子特征分析和功能鑒定： (1) ERF轉(zhuǎn)錄因子的體外結(jié)合特異性分析：PCR擴(kuò)增ERF轉(zhuǎn)錄因子基因TaEREB1/2、TaERFL1/2 AP2/EREBP區(qū)，構(gòu)建原核表達(dá)載

3、體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG(0.5 m mol·L<'-1>，3～5 h)誘導(dǎo)，GST純化柱純化，純化的融合蛋白與[γ-<'32>P[ATP標(biāo)記的ERE、DRE探針混合進(jìn)行凝膠阻滯試驗(yàn)。結(jié)果表明TaEREB1/2、TaERFL1/2都能與ERE、DRE順式元件體外特異結(jié)合，與突變ERE、DRE探針不結(jié)合，可能同時(shí)應(yīng)答生物與非生物脅迫，參與多種信號(hào)途徑。 (2) ERF轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位分析：把目的基因插入到3

4、5S啟動(dòng)子和綠色熒光蛋白(GFP)基因之間，構(gòu)建ERF轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位重組載體。通過基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，暗培養(yǎng)24 h后共聚焦顯微鏡下觀察，驗(yàn)證ERF基因是否具有核定位功能。結(jié)果表明TaEREB1、TaEREB2、TaERFL1、TaERFL1都能定位于細(xì)胞核，可通過自身的NLS轉(zhuǎn)位入核行使功能(3) ERF轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)特性分析：對(duì)小麥材料進(jìn)行各種脅迫處理(ABA、SA、MeJA、低溫和高鹽)，提取總RNA，純化，反轉(zhuǎn)錄成c

5、DNA，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)對(duì)ERF轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行表達(dá)特性分析。結(jié)果表明TaEREBl1/2、TaERFLl/2基因受．ABA、SA、MeJA、低溫和高鹽的誘導(dǎo)，但對(duì)各種脅迫響應(yīng)的時(shí)間不一樣。表明TaEREB1/2、TaERFL1/2可能參與多種信號(hào)途徑，但在各種脅迫信號(hào)途徑中發(fā)揮不同的作用。 (4) ERF轉(zhuǎn)錄因子的擬南芥轉(zhuǎn)化：構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥，為進(jìn)一步對(duì)ERF基因做功能分析奠定基礎(chǔ)。這些研究結(jié)果為深