載銀介孔氧化硅新型納米菌材料體外抗菌性能及生物相容性能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分載銀介孔氧化硅新型納米抗菌材料抗菌性能研究
　　背景:載銀介孔氧化硅(Ag-MSN)材料生物相容性好，機(jī)械性能佳，具有載藥潛力及可控緩釋藥物能力，可望成為良好的骨替代材料抗菌載藥顆粒。
　　目的:本實(shí)驗(yàn)通過對該材料的體外抗菌性能及Ag+緩釋特點(diǎn)進(jìn)行研究，探討其應(yīng)用于填充慢性骨髓炎術(shù)后骨缺損的可行性。
　　方法:采用標(biāo)準(zhǔn)肉湯稀釋法及OD600細(xì)菌生長曲線測定法檢測不同濃度的Ag-MSN混懸液及MSN混懸液對于金葡

2、菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌/脆弱擬桿菌和白色念珠球菌的體外抗菌效果。將Ag-MSN混懸液分別浸泡于50 ml模擬體液(simulated body fluid，SBF)中，于3h/6h/12h/1d/3d/7d/10d/14d采用火焰原子吸收光譜法檢測Ag+濃度，繪制銀離子釋放曲線，檢測材料的Ag+緩釋特點(diǎn)。
　　結(jié)果:Ag-MSN對于金葡菌/銅綠假單胞菌/大腸桿菌/脆弱擬桿菌的最小抑菌濃度(MIC)均≤200μg/ml，而最小殺

3、菌濃度(MBC)則分別為400/200/200/200μg/ml，中間濃度材料浸提液相對于對照組能顯著抑制細(xì)菌生長;但材料對于真菌——白色念珠球菌無明顯殺菌效果，在400μg/ml濃度下僅能抑制其生長;Ag-MSN各濃度組SBF浸泡液中的銀離子總釋放趨勢基本一致，均于浸泡6小時(shí)后達(dá)到銀離子釋放的峰值，浸泡3d后銀離子釋放漸趨穩(wěn)定，與浸泡14天內(nèi)無明顯差異400，200組在14天內(nèi)均維持在銀離子生物安全濃度與最小抑菌濃度MIC之間。

4、>　　結(jié)論:載銀介孔氧化硅(Ag-MSN)材料在體外對金黃色葡萄球菌/大腸桿菌/銅綠假單胞菌/脆弱擬桿菌有明顯抗菌作用，對于白色念珠球菌有抑菌作用。其在SBF中具有良好的緩釋效果，有望成為針對慢性骨髓炎的良好的新型骨替代材料抗菌載藥顆粒。
　　第二部分載銀介孔氧化硅新型納米抗菌材料對于成骨樣細(xì)胞增殖分化能力的影響
　　目的:檢測不同濃度載銀介孔氧化硅(Ag-MSN)及介孔氧化硅納米顆粒浸提培養(yǎng)液的細(xì)胞毒性，及其對成骨樣細(xì)胞增

5、殖分化能力的影響，探討其生物相容性及將來應(yīng)用于填充慢性骨髓炎術(shù)后骨缺損的可行性。
　　方法:采用CCK8法檢測不同濃度的Ag-MSN浸提培養(yǎng)液及MSN浸提培養(yǎng)液對于成骨樣細(xì)胞的細(xì)胞毒性及對其增值能力的影響。分別于共培養(yǎng)1，3，7天時(shí)采用ELISA法檢測與不同組別浸提培養(yǎng)液共培養(yǎng)后的成骨樣細(xì)胞的堿性磷酸酶(ALP)，骨鈣素(OC)的蛋白分泌量。實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)法檢測堿性磷酸酶(ALP)，骨鈣素(OC)基因表達(dá)的變化。

6、
　　結(jié)果:在檢測的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)下，4組不同濃度的Ag-MSN材料浸提液與MSN浸提液培養(yǎng)下的成骨樣細(xì)胞生長良好，各實(shí)驗(yàn)組與對照組的細(xì)胞數(shù)目均隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，各實(shí)驗(yàn)組均未抑制成骨樣細(xì)胞的增殖功能。細(xì)胞毒性CTS分級均為0-1級，未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。成骨樣細(xì)胞在不同濃度的Ag-MSN及MSN浸提培養(yǎng)液培養(yǎng)下與對照組的成骨樣細(xì)胞一樣，ALP活性隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，高濃度的Ag-MSN浸提培養(yǎng)液及MSN浸提培養(yǎng)液能提高

7、ALP的基因表達(dá)和蛋白分泌量及OC基因的表達(dá)，與對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，但對BGP蛋白分泌量則無明顯影響(P＞0.05)。
　　結(jié)論:Ag-MSN與MSN均有較好的生物相容性，無細(xì)胞毒性。同時(shí)Ag-MSN與MSN浸提培養(yǎng)液均有一定的骨誘導(dǎo)作用。
　　第三部分載銀介孔氧化硅新型納米抗菌材料對于成骨樣細(xì)胞OPG/RANKL通路的影響
　　目的:檢測不同濃度載銀介孔氧化硅(Ag-MSN)及介孔氧化硅納米顆粒浸提培

8、養(yǎng)液對成骨樣細(xì)胞破骨細(xì)胞分化相關(guān)通路---OPG/RANKL通路的影響，在體外實(shí)驗(yàn)中從分子蛋白水平探討材料是否會(huì)通過OPG/RANKL通路影響骨重建。
　　方法:采用不同濃度的Ag-MSN浸提培養(yǎng)液及MSN浸提培養(yǎng)液作為檢測液體與成骨樣細(xì)胞共培養(yǎng)。分別于共培養(yǎng)1，3，7天時(shí)采用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)法檢測OPG, RANKL基因表達(dá)的變化。采用Western Blot法檢測與不同組別浸提培養(yǎng)液共培養(yǎng)后的成骨樣細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)的

9、護(hù)骨素(OPG)與破骨細(xì)胞分化因子（RANKL）蛋白分泌量的變化趨勢。
　　結(jié)果:qRT-PCR結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組與對照組的OPG基因表達(dá)量自第3天開始逐漸升高，其后一直維持在較高水平，各實(shí)驗(yàn)組與對照組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。而RANKL的基因表達(dá)量在共培養(yǎng)第7天著升高，對照組與各實(shí)驗(yàn)組均表現(xiàn)了這一特性，組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。Western Blot結(jié)果顯示，共培養(yǎng)7天后，各實(shí)驗(yàn)組及對照組成骨樣細(xì)胞中OPG蛋白

10、量無明顯差異，但實(shí)驗(yàn)組的RANKL蛋白表達(dá)量較對照組有輕度升高，其中高濃度的400μg/ml Ag-MSN組與400μ g/ml MSN組升高較為明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:在體外共培養(yǎng)的早期，即成骨樣細(xì)胞分化至成熟階段，Ag-MSN與MSN對于成骨/破骨細(xì)胞間的OPG/RANKL通路無明顯影響，但在成骨樣細(xì)胞成熟期，高濃度的Ag-MSN及MSN會(huì)通過增加成骨細(xì)胞RANKL蛋白的表達(dá)進(jìn)而輕度活化破骨細(xì)胞。但其是否在體內(nèi)通過這一