NADH再生系統(tǒng)和乙醇突變株的構(gòu)建及其生產(chǎn)1，3-丙二醇初步研究.pdf

1、還原力NADH是微生物產(chǎn)生1,3-丙二醇途徑必需的物質(zhì)。微生物在生成1,3-丙二醇的途徑中伴隨著很多副產(chǎn)物,如乙醇、乳酸、琥珀酸、2,3-丁二醇(2,3-BD)等,這些副產(chǎn)物的生成與1,3-丙二醇產(chǎn)生途徑競(jìng)爭(zhēng)NADH。本工作一方而在野生型K. oxytocaM5al中引入NADH再生系統(tǒng),另一方面將K. oxytoca M5al中產(chǎn)生乙醇的途徑阻斷掉,以使更多的NADH流向1,3-丙二醇產(chǎn)生途徑。 在M5al中構(gòu)建了NADH再生

2、系統(tǒng)(pDK7-fdh),為了重組質(zhì)粒pDK7-fdh能夠在細(xì)胞繁殖過程中穩(wěn)定遺傳,在重組質(zhì)粒pDK7-fdh中引入了質(zhì)粒平均分配基因parDE得到重組菌株F6。F6在傳代160代后質(zhì)粒僅丟失3％,甲酸脫氫酶(FDH)酶活與傳代前相比只降低了1.77％；而不含parDE的重組菌FY和F-1傳代160代后質(zhì)粒分別丟失了78％和93％,FDH比酶活分別降低了25％和49％。上罐檢測(cè)甲酸脫氫酶酶活表明F6最高比酶活為26.32 U/mg,是M

3、5al最高比酶活10.79U/mg的2.43倍。 F6搖瓶實(shí)驗(yàn)表明,加入甲酸脫氫酶的底物甲酸鈉后,1,3-丙二醇的生產(chǎn)強(qiáng)度明顯加強(qiáng),發(fā)酵47 h達(dá)到0.3 g·l-1h-1,而沒有加入甲酸鈉的F6只有0.19 g·l-1h-1;且添加甲酸鈉后副產(chǎn)物乙酸提高了7.2倍,乙醇產(chǎn)量提高了1.2倍。另外,F6和M5al發(fā)酵58 h的1,3-丙二醇產(chǎn)量并沒有明顯提高,分別是13.75g/l和13.16g/l,但是乙醇和乙酸的產(chǎn)量分別提高了

4、24％和30％,且F6的生長(zhǎng)加快。 另外,利用自殺載體pGPCm和pGPKm成功構(gòu)建了aldH缺失突變株(MH)和adhE缺失突變株(ME)。比酶活測(cè)定結(jié)果顯示,MH的ADH與M5al相差不大,分別為11.44U/mg和11.86 U/mg,而ALDH比酶活為0.796 U/mg,是M5al的22％；ME的ADH比酶活只有4.74 U/mg,是M5al的40％,ALDH比酶活是0.934 U/mg,為M5al的26％。在有氧和厭

5、氧條件下,ME都幾乎沒有乙醇產(chǎn)生,而M5al乙醇最高產(chǎn)量分別為3.29 g/l和1.1 g/l。搖瓶發(fā)酵表明,在阻斷了菌體的乙醇生成途徑后,ME的生長(zhǎng)速率明顯降低,由此造成甘油消耗率降低,1,3-丙二醇的生成速率也隨之降低。但是另一種化工和食品中十分有用的產(chǎn)物--2,3-丁二醇的生成卻明顯升高,發(fā)酵48 h 2,3-丁二醇的產(chǎn)量是10.23 g/l,比M5al提高了51％；延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間至72 h后1,3-丙二醇的產(chǎn)量最高為15.89g/