Heparosan的提取分離及其對腸道菌作用的研究.pdf

1、heparosan為糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)家族一員，是某些細菌莢膜多糖成分，同時也是肝素和硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)的生物合成前體。肝素和HS是生物體很重要的一類多糖物質(zhì)，參與體內(nèi)的多種生物過程，如胚胎發(fā)育、細胞生長分化、血液凝固、脂質(zhì)代謝、炎癥反應、血管生成，細胞信號傳導和微生物感染等。肝素作為重要的抗凝血和抗血栓藥物廣泛應用于臨床，此外，還具有調(diào)血脂、抗炎、抗癌等作用。近年來

2、，肝素的抗感染作用受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，外源性肝素可阻止或抑制多種傳染性病原微生物對真核細胞的感染，包括病毒，細菌以及寄生蟲。肝素對多種病原微生物的黏附或侵入抑制作用，使其具有開發(fā)為廣譜抗感染制劑的潛能。由于肝素本身具有很強的抗凝活性，外源性肝素的應用，可引發(fā)出血等不良反應，須嚴格控制劑量和操作，限制了其進一步開發(fā)。heparosan的二糖骨架結(jié)構(gòu)與肝素或HS類似，但未硫酸化，也沒有將葡糖醛酸異構(gòu)化為艾杜糖醛酸，不具抗凝活性，可直接細菌發(fā)

3、酵提取獲得，還可通過硫酸化或異構(gòu)化修飾生成多種具有相似結(jié)構(gòu)的衍生物。研究發(fā)現(xiàn)，heparosan及其衍生物具有多種與肝素類似的活性，如抗凝、抗炎、抗病毒及抗癌等。而heparosan在細菌感染等方面的作用尚未見相關(guān)報道。本課題研究了heparosan對部分腸道菌體外黏附及定殖的影響和體內(nèi)對腸道菌群的整體調(diào)節(jié)作用以及預防病原菌感染的效果，為其在抗感染方面的開發(fā)提供依據(jù)。
　　 1 heparosan的提取分離
　　 目的：

4、通過多殺性巴氏桿菌D型菌株P(guān)-934的培養(yǎng)提取heparosan，并對其進行純化和鑒定。
　　 方法：以heparosan產(chǎn)量為主要指標，通過對碳源、金屬離子等培養(yǎng)基組成以及接種量、搖瓶裝液量等條件的考察，確定最終培養(yǎng)條件。確定heparosan提取純化的主要工藝步驟，并對影響純化的關(guān)鍵因素進行優(yōu)化，實現(xiàn)heparosan的高效分離。參考相關(guān)文獻報道，對heparosan進行鑒定及含量測定。
　　 結(jié)果：優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)

5、基組成為牛腦心浸粉20 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖20g/L，NaCl5～g/L，MgSO40.2g/L，MnCl20.5 g/L，pH7.2，在250 mL錐形瓶中裝液量為50 mL，接種體積分數(shù)為5％，培養(yǎng)周期48 h。heparosan產(chǎn)量由腦心浸液培培養(yǎng)基中的0.13 g/L增長為0.41g/L。所用提取純化工藝較為簡單，除菌體后，上清液采用氯化十六烷基吡啶沉淀，所得沉淀經(jīng)氯化鈉溶液復溶后醇沉即可得到heparosan。

6、通過對醇沉氯化鈉濃度的控制，實現(xiàn)heparosan的高效分離。經(jīng)肝素酶Ⅲ降解和1H-NMR分析測定，確定所得提取產(chǎn)物為heparosan。本提取分離工藝所得heparosan純度達98％以上。
　　 結(jié)論：通過對培養(yǎng)條件的改善，提高了野生型菌株heparosan的產(chǎn)量，工藝簡便可行，所得heparosan純度較高，適用于后續(xù)實驗。
　　 2 heparosan體外對部分腸道菌黏附和定殖的影響
　　 目的：考察he

7、parosan體外對常見腸道菌黏附以及定殖的影響。
　　 方法：通過HT-29細胞培養(yǎng)建立腸道上皮細胞模型，采用黏液素和牛血清白蛋白模擬黏液層主要成分建立黏液層模型，考察heparosan對腸致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌和沙門氏菌等常見腸道致病菌以及益生菌鼠李糖乳酸桿菌黏附腸道上皮細胞和黏液層的影響。此外，通過heparosan對金黃色葡萄球菌和鼠李糖乳酸桿菌生物膜形成能力的考察，評價heparosan對生物膜

8、形成菌株定殖的影響。同時對比肝素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸等常見GAG以及荷正電殼聚糖的作用效果。
　　 結(jié)果：heparosan可抑制部分病原菌的黏附，且抑制作用隨濃度增大而增加，50μg/mL heparosan即可顯著抑制腸致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和多殺性巴氏桿菌等對HT-29腸道上皮細胞和黏液層模型的黏附，但對鼠李糖乳酸桿菌的黏附則無明顯影響。當鼠李糖乳酸桿菌濃度較低時，heparosan可顯著增強其對腸致病性大腸桿菌

9、的競爭和抵御作用。heparosan對實驗考察菌株的黏附抑制效果與肝素類似，兩者之間并無顯著性差異。heparosan對病原菌的黏附抑制作用可能因其具有與肝素或HS類似結(jié)構(gòu)。heparosan對鼠李糖乳酸桿菌和金黃色葡萄球菌的生物膜形成無明顯影響，而肝素可顯著增強鼠李糖乳酸桿菌的生物膜形成，提高幅度達40％以上，這可能主要歸因于肝素很強的荷負電性質(zhì)。
　　 結(jié)論： heparosan對常見病原菌具有顯著的黏附抑制作用，而對益生菌

10、無明顯影響，可相對增加益生菌的競爭優(yōu)勢。heparosan具有開發(fā)為抗病原菌感染制劑的潛在價值。
　　 3 heparosan對腸道菌群的整體調(diào)節(jié)作用和體內(nèi)抗感染效果
　　 目的：考察heparosan對大鼠腸道菌群的整體調(diào)節(jié)作用以及體內(nèi)預防病原菌感染的效果。
　　 方法：實驗大鼠隨機分為3組，分別給予生理鹽水，0.5 mg/mL和1 mg/mL heparosan溶液，灌胃劑量為每100 g體重1mL，每日給藥

11、1次，連續(xù)2周。分別取第7日、14日糞便樣品，經(jīng)變性梯度凝膠電泳分析，選取heparosan處理組與生理鹽水組差異條帶，測序并進行菌群分析，比較腸道菌群組成變化，評價heparosan對優(yōu)勢菌株的影響。實驗大鼠采用腸致病性大腸桿菌懸浮液連續(xù)灌胃3 d，誘發(fā)腸炎，考察heparosan對病原菌感染的預防效果。
　　 結(jié)果：與生理鹽水組相比，heparosan處理組大鼠腸道菌群中乳酸桿菌屬益生菌的比例顯著提高。腸致病性大腸桿菌灌注后