纖維連接蛋白在漢坦病毒感染致病中作用的初步研究.pdf

1、漢坦病毒（Hantavirus）屬于布尼亞病毒科，是一種有包膜的單股負鏈RNA病毒。漢坦病毒主要引起兩種急性傳染病，一種是腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS），該病是我國重點防治的傳染??；另一種是漢坦病毒肺綜合征（Hantavirus pulmonary syndrome，HPS），主要流行于美洲國家。
　　HFRS是以發(fā)熱、出血和腎功能損害為主要特征的一種急性病毒

2、性傳染病。病毒感染人體后可以侵犯內(nèi)皮細胞和多種免疫細胞，誘生各類細胞因子的變化，最終導致免疫系統(tǒng)紊亂、血管通透性增加等一系列病理改變。但其具體機制尚未完全闡明，有待進一步研究。
　　病毒的感染并非是泛嗜性的，每一種病毒通常只能感染某種或某些特定的靶細胞。通常，病毒由靶細胞表面的特異分子介導病毒進入細胞，該分子可作為病毒受體參與病毒的識別與結(jié)合等過程。病毒與細胞膜表面受體結(jié)合是病毒感染致病的第一步。β3整合素已確認為致病性漢坦病毒的

3、受體，β3整合素上的PSI結(jié)構(gòu)域（plexin-semaphorin–integrin，PSI）是漢坦病毒與整合素相互作用的位點。然而，近年來有研究報道，網(wǎng)格蛋白（clathr in）相關(guān)的受體可能介導了漢坦病毒的吸附和入胞過程，但由于抑制網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞作用并同時抑制β3整合素并不能完全阻斷漢坦病毒的內(nèi)化，因此漢坦病毒很可能還存在其他的內(nèi)化通路。另外，本實驗室前期在應用Ras募集（Ras recruitment system，RRS）酵

4、母雙雜交系統(tǒng)研究漢坦病毒包膜糖蛋白相互作用分子，尋找病毒受體的研究中發(fā)現(xiàn)，漢坦病毒包膜糖蛋白G1、G2均可以與纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）相互作用。FN是由血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞和肝臟產(chǎn)生的一種多功能蛋白質(zhì),它的合成和降解由轉(zhuǎn)化生長因子β（TGFβ）調(diào)節(jié)。研究表明，F(xiàn)N在多種病毒感染過程中起重要作用，與病毒的入胞過程和致病過程密切相關(guān)。
　　那么，漢坦病毒是否還存在著其他入胞途徑？FN在漢坦病毒感染過程中又有

5、什么作用呢？是否能輔助病毒入胞，以及是否在漢坦病毒感染致病中起重要作用？基于以上疑問，圍繞FN進行了如下研究：
　　1、FN與漢坦病毒核衣殼蛋白及小窩蛋白的共定位研究
　　已知網(wǎng)格蛋白依賴型入胞途徑和小窩蛋白依賴型內(nèi)吞途徑是許多病毒入胞的重要途徑。為了確定漢坦病毒是否可以由FN介導經(jīng)小窩途徑入胞，我們研究了漢坦病毒與FN及小窩蛋白在細胞內(nèi)的共定位關(guān)系。首先基于空斑形成實驗的實驗結(jié)果，應用微量細胞培養(yǎng)法（雙抗夾心ELISA）測

6、定漢坦病毒的TCID50，對病毒感染滴度進行了滴定。在此基礎(chǔ)上，應用共聚焦顯微鏡分別觀察了漢坦病毒感染的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（HUVEC）中漢坦病毒與FN和小窩蛋白在感染細胞內(nèi)亞細胞水平的共定位關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)漢坦病毒NP與FN和小窩蛋白可以共定位于HUVEC的細胞膜和細胞核周區(qū)域,從而說明了漢坦病毒的入胞途徑除了可以通過網(wǎng)格蛋白依賴的入胞途徑外，可能還可通過FN介導的小窩蛋白途徑進入細胞。
　　2、不同F(xiàn)N片段對漢坦病毒感染的競爭

7、抑制試驗
　　為進一步明確FN分子在漢坦病毒感染中的作用，我們應用5種FN片段進行了漢坦病毒感染競爭抑制試驗，以確定FN分子中的哪個結(jié)構(gòu)片段或者哪種形式在漢坦病毒感染過程中起作用。具體方法是采用重組全長FN、細胞結(jié)合片段、連接區(qū)片段、鉸鏈區(qū)片段、硫酸肝素結(jié)合片段競爭抑制漢坦病毒感染敏感細胞 HUVEC。用ELISA試驗分別檢測病毒抗原，結(jié)果表明，5種FN片段無論加入的濃度高低，對漢坦病毒的感染均有一定的抑制作用。特別是40kDa的

8、連接區(qū)片段對漢坦病毒感染的抑制作用具有濃度依賴性，即隨著其濃度的增加病毒的載量也漸次減低。其余4種片段對漢坦病毒感染的阻抑作用并未隨著加入片段的濃度升高而增強，因此其阻抑病毒感染的作用可能具有非特異性。
　　3、腎綜合征出血熱患者不同病期外周血FN及TGF-β1的動態(tài)變化
　　為探求FN及其相關(guān)因子TGF-β1在漢坦病毒致病中的作用，共采集了HFRS患者不同病期的血清、血漿樣本各260份，以及正常人血樣30份。首先應用Wes

9、tern-blot檢測到HFRS患者血清中含有FN；繼而應用ELISA法對HFRS患者及健康人血清、血漿中FN及其相關(guān)細胞因子TGF-β1進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HFRS患者不同病期血漿中FN水平隨病期的推移呈波動升高趨勢，其中發(fā)熱期、低血壓休克期、少尿期患者血漿中FN水平均低于正常對照組。多尿期、恢復期血漿中FN水平均高于正常對照組（P<0.05）。HFRS患者不同病期血清中FN水平均低于正常對照組（P<0.05），HFRS病程五期相比，

10、少尿期FN的表達水平均高于其他四期。HFRS患者不同病期血漿中TGF-β1水平均高于正常對照組，并隨病程的發(fā)展呈現(xiàn)波動趨勢，特別是病程最重的低血壓休克期血漿中TGF-β1水平顯著增高（P<0.05）；血清中TGF-β1的表達水平與血漿中TGF-β1的表達水平基本一致。
　　綜上所述，在漢坦病毒感染過程中，F(xiàn)N有可能起到多種作用。在漢坦病毒感染時，病毒可能通過由組織型FN介導的小窩途徑入胞，且其FN連接區(qū)部位可能起到關(guān)鍵作用。同時，