雄黃微生物浸出液抗腫瘤作用研究.pdf

1、目前，隨著雄黃在腫瘤治療中的應(yīng)用日益為人們所關(guān)注，它的水難溶解性所造成的制劑困難，提高其生物利用度，拓寬臨床應(yīng)用等問(wèn)題迫切需要解決。本研究采用微生物對(duì)雄黃進(jìn)行生物浸出處理以提高其溶解度和生物利用度：利用實(shí)驗(yàn)室分離的氧化亞鐵硫桿菌和或氧化硫硫桿菌制備雄黃的浸出液并對(duì)工藝進(jìn)行系統(tǒng)的研究；以白血病K562和K562ADM細(xì)胞為模型，研究了雄黃的浸出液對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用；采用毛細(xì)管電泳分析法對(duì)雄黃生物浸出液進(jìn)行分離分析以

2、期確定它的藥效成分；對(duì)雄黃生物浸出液的急性毒性和藥物動(dòng)力學(xué)進(jìn)行考察。主要研究結(jié)果如下： 1．在有和沒(méi)有亞鐵離子的浸出體系下，氧化亞鐵硫桿菌、氧化硫硫桿菌制備雄黃的浸出液的最佳浸出條件為：30℃，pH 1.80，150轉(zhuǎn)/分，浸出時(shí)間30天。在浸出體系有鐵離子參與時(shí)，雄黃浸出液中砷的浸出率與無(wú)亞鐵離子的浸出體系的相比，有很大的提高。氧化亞鐵硫桿菌組雄黃浸出液中砷的浸出率，從10％迅速增長(zhǎng)到43％；而氧化硫硫桿菌組僅從21％變化到2

3、3％；雄黃混合菌浸出液中砷的浸出率提高最快，從16％增加到56％只需20天。因此混合菌生物浸出雄黃是最佳工藝。通過(guò)電鏡掃描，能譜技術(shù)和X-射線衍射技術(shù)對(duì)細(xì)菌與雄黃作用的研究結(jié)果表明，混合菌作用雄黃是直接和間接作用的綜合結(jié)果。 2．為確證雄黃生物浸出液的生物效應(yīng)，以相同濃度亞砷酸和常規(guī)粉體作為對(duì)照組，用噻唑藍(lán)(MTT)方法研究了三者對(duì)K 562和K562ADM細(xì)胞增殖的影響；應(yīng)用激光共聚焦熒光顯微鏡、瓊脂糖凝膠電泳、流式細(xì)胞術(shù)及R

4、T-PCR技術(shù)研究其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雄黃浸出液可明顯抑制K562和K562ADM細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具體表現(xiàn)為細(xì)胞體積縮小、細(xì)胞核的濃縮、典型的“DNAladder”電泳條帶和較高的凋亡率。細(xì)胞經(jīng)特異性抗體熒光標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)以及RT-PCR等研究，雄黃浸出液可使白血病細(xì)胞Fas和Caspase-3蛋白的表達(dá)的上調(diào)，bcl-2蛋白或p-gp蛋白的表達(dá)下調(diào)，這可能是雄黃微生物浸出液誘導(dǎo)K562和K562ADM細(xì)胞凋亡的

5、重要的分子機(jī)制。以上結(jié)果表明雄黃浸出液比原料雄黃表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，且在此過(guò)程中，雄黃浸出液可能是通過(guò)釋放可溶性砷，來(lái)發(fā)揮其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。 3．用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法可以簡(jiǎn)單，快速，有效的分析雄黃浸出液的四種砷類化合物(As<'Ⅲ>、iAs<'Ⅴ>、MMA<'Ⅴ>和DMA<'Ⅴ>)。采用優(yōu)化條件BGE:PDC/10mM與CTAOH/1mM分離條件：電壓25 kV、溫度25℃、pH 11.0、紫外檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定

6、在216nm。通過(guò)比較可以看出，雄黃浸出液與砷酸所含砷類化合物的種類部分相同(As<'Ⅲ>和iAs<'Ⅴ>)，其中混合菌浸出液與砷酸成分差異最大，同時(shí)含有三種砷化合物(As<'Ⅲ>和iAs<'Ⅴ>MMA<'Ⅴ>)。 4．急性毒性實(shí)驗(yàn)表明：雄黃制備成雄黃浸出液后急性毒性增大。小鼠灌胃或小鼠腹腔半數(shù)致死量LD<,50>：雄黃氧化硫硫桿菌組毒性最大(0.0346±0.0030mg/ml)，其次為混合菌組(0.0737±0.0080 m

7、g/ml)，再次為氧化亞鐵硫桿菌組(0.2351±0.034 mg/ml)，然后才為亞砷酸(0.2656±0.0338 mg/ml)和常規(guī)粉體(83.701±0.6912 mg/ml)。從這一點(diǎn)上來(lái)講，雄黃中的溶解砷具有毒性與活性的雙向作用。按照劑量與LD50比值相同的原則，篩選毒性與亞砷酸相近的雄黃氧化亞鐵硫桿菌浸出液，適當(dāng)調(diào)整浸出液的給藥劑量，進(jìn)行藥物動(dòng)力學(xué)研究，防止中毒反應(yīng)發(fā)生，是非常有必要的。 5．雄黃制成氧化亞鐵硫桿菌

8、浸出液后，對(duì)砷在大鼠體內(nèi)的吸收和消除過(guò)程均有影響。雄黃常規(guī)粉體經(jīng)口服形式給藥，所含砷在大鼠心、肝、脾、肺、腦等組織的分布遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于以腹腔注射雄黃浸出液和亞砷酸。雄黃亞鐵硫桿菌浸出液及亞砷酸組的AUC值分別比常規(guī)粉體的AUC值增加了294.38％和275.73％。經(jīng)過(guò)調(diào)整氧化亞鐵硫桿菌浸出液的給藥劑量后，雄黃的藥用劑量減少，其生物利用度大大提高，毒性降低，藥效提高。這就使得采用微生物對(duì)雄黃進(jìn)行生物浸出處理以提高其溶解度和生物利用度的研究，具