Poly(A)尾的長度對DHAV-1增殖的影響.pdf

1、A型鴨病毒性肝炎是由鴨甲肝病毒(Duck Hepatitis A virus，DHAV)引起的一種主要感染1～3周齡雛鴨急性和高度致死性的疾病。雛鴨死亡后有明顯的角弓反張神經(jīng)性癥狀，肝臟腫大且表面有出血點或者彌漫性出血。該病毒引起的鴨病毒性肝炎呈世界性分布，且具有高度傳染性，是嚴重危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要疾病之一。隨著近兩年來人們對鴨病毒性肝炎的關(guān)注，DHAV的全基因組序列逐漸公布于世，但國內(nèi)外學者對該病的注意力集中在病原學研究及檢測方法研究，

2、對病毒的復制及感染機制研究仍然處于上世紀的組織學和血清學水平。眾多研究表明小RNA病毒科成員的復制和翻譯水平與病毒的5′UTR和3′UTR具有密切的關(guān)系，且poly(A)尾結(jié)構(gòu)對病毒的增殖和毒力均有重要作用。但目前尚無關(guān)于DHAV-1的poly(A)尾與病毒復制及毒力相關(guān)性的報道。本實驗室前期已經(jīng)構(gòu)建了DHAV-1 LY0801株感染性克隆并成功獲得了拯救病毒粒子，拯救病毒粒子與母本病毒具有相似的增殖能力和毒力水平。但需要進行體外轉(zhuǎn)錄，

3、增加了實驗繁瑣性和實驗經(jīng)費。本課題在已經(jīng)構(gòu)建的感染性克隆基礎(chǔ)上，在病毒序列的兩端添加了兩個具有自我剪切性質(zhì)的核酶序列，構(gòu)建了具有更高轉(zhuǎn)染效率的DHAV-1 LY0801株DNA-Launched感染性克隆，直接轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒即可獲得拯救病毒粒子。同時通過引物設(shè)計增長和縮短poly(A)尾的長度，構(gòu)建一系列帶有不同長度poly(A)尾的DNA-Launched感染性克隆，分別測定帶有不同長度poly(A)尾的病毒的增殖和感染能力，以闡明DH

4、AV-1 poly(A)尾對病毒增殖和毒力的影響。
　　1、DHAV-1 LY0801株的DNA-Launched感染性克隆的構(gòu)建
　　參考載體pEGFP-N2多克隆位點區(qū)與DHAV-1忠實cDNA序列內(nèi)部酶切位點，設(shè)計四對特異性引物將DHAV-1全基因組分為4個片段定向克隆到載體。通過引物設(shè)計的方法在病毒基因組的兩端添加兩個具有自我剪切性質(zhì)的核酶錘頭狀核酶(hammerhead ribozyme)與丁型肝炎病毒核酶(hep

5、atitis delta virus ribozyme)。通過引物設(shè)計，人工誘變第3042位堿基(T→C)并形成一個序列中本身不存在的BamHI位點，且該堿基突變未引起氨基酸序列的改變。新形成的BamHI位點作為遺傳標簽區(qū)分母本病毒與拯救病毒粒子。
　　將DHAV-1 DNA-Launched感染性克隆進行全基因組測序后發(fā)現(xiàn)除3042位堿基為人工誘變外，其他堿基及氨基酸序列均未發(fā)生突變。將重組質(zhì)粒進行定量后直接轉(zhuǎn)染BHK-21細胞

6、，并以母本病毒感染BHK-21細胞作為陽性對照，以無菌的PBS為陰性對照。轉(zhuǎn)染60h后收集細胞培養(yǎng)物并反復凍融三次后，接種空白BHK-21細胞。連續(xù)傳代三次后，在感染60h后進行CPE的觀察和IFA、RT-PCR的檢測。經(jīng)鑒定結(jié)果均為陽性，表明成功獲得拯救病毒粒子。
　　2、拯救病毒的部分生物學特性研究
　　轉(zhuǎn)染60h后收集細胞培養(yǎng)物，反復凍融三次后感染空白BHK-21細胞。連續(xù)傳代三次后，感染6孔板中的BHK-21細胞，每

7、隔12h分別收集細胞上清及細胞，母本病毒和無菌PBS感染BHK-21作為陽性對照和陰性對照，實時熒光定量PCR測定各個時間段病毒增殖和毒力特點。細胞和細胞上清中的增殖特點表明拯救病毒粒子和母本病毒粒子具有相似的增殖和毒力特點。
　　為了衡量拯救病毒與母本病毒的毒力水平，將60只雛鴨分別分為三個組。第一組和第二組分別為拯救病毒組和母本病毒組，分別腿部肌肉注射0.25ml(104TCID50)的拯救病毒和母本病毒，對照組腿部肌肉注射0

8、.25ml無菌PBS，結(jié)果顯示拯救病毒與母本病毒具有相似的毒力，死亡雛鴨表現(xiàn)為明顯的鴨病毒性肝炎臨床癥狀。
　　為了確定拯救病毒粒子與母本病毒粒子具有相似的組織嗜性，將100只雛鴨隨機分為兩組，分別腿部肌肉注射0.25ml(104TCID50)的拯救病毒和母本病毒粒子，攻毒后1h，6h，12h，18h，24h，48h和72h后分別收取雛鴨的心臟，肝臟，腎臟，脾臟，胸腺和法氏囊組織并用實時熒光定量PCR測定組織中的病毒含量。組織切片

9、結(jié)果表明兩組病毒均可引起典型的鴨病毒性肝炎臨床癥狀。表明拯救病毒與母本病毒具有相似的組織嗜性。
　　3.Poly(A)尾的長度對DHAV-1的增殖和毒力的影響
　　通過引物設(shè)計的方法，將poly(A)尾的長度分別突變?yōu)?/5/10/15/20/25/30/40個堿基A，獲得一系列帶有不同長度poly(A)尾的DNA-Launched感染性克隆。將帶有不同長度poly(A)尾的DNA-Launched感染性克隆轉(zhuǎn)染BHK-21

10、細胞后，每隔12h分別收集細胞上清和細胞，提取病毒RNA，并用DNasI消除殘留DNA的影響，實時熒光定量PCR測定病毒拷貝數(shù)，并繪制生長曲線。細胞組中的增殖特點為24hpt到48hpt細胞內(nèi)病毒拷貝數(shù)逐漸下降，從48hpt到60hpt病毒拷貝數(shù)又開始上升。細胞上清組中的病毒拷貝數(shù)特點為24hpt到48hpt細胞上清中的病毒拷貝數(shù)逐漸上升，而后在48hpt到60hpt病毒拷貝數(shù)又開始下降。細胞內(nèi)的病毒拷貝數(shù)代表病毒在BHK-21細胞中的

11、增殖特點，試驗結(jié)果表明poly(A)25組感染性克隆具有最高的復制水平。細胞上清中本身不存在病毒RNA，因此細胞上清中的病毒拷貝數(shù)代表病毒的感染能力，試驗結(jié)果表明poly(A)20組具有最高的病毒毒力水平。此外，細胞中病毒增殖特點與細胞總內(nèi)容物中的增殖特點相似，表明細胞中的病毒含量遠大于細胞上清中的病毒含量。
　　4.Poly(A)0組DNA-Launched感染性克隆拯救病毒粒子增殖特點研究
　　在poly(A)長度對DH

12、AV-1增殖相關(guān)性試驗中我們發(fā)現(xiàn)細胞組中poly(A)0組DNA-Launched感染性克隆拯救病毒粒子在48hpt后病毒拷貝數(shù)開始上升。為了確定無poly(A)尾DHAV-1能否增殖，將poly(A)0組DNA-Launched感染性克隆轉(zhuǎn)染BHK-21細胞并收集細胞培養(yǎng)產(chǎn)物。細胞培養(yǎng)產(chǎn)物反復凍融三次后接種空白BHK-21細胞，連續(xù)傳代三次后進行RT-PCR、IFA檢測。經(jīng)鑒定結(jié)果均為陽性，表明成功獲得了拯救病毒粒子。這充分說明pol

13、y(A)尾對DHAV-1的增殖和感染不是必需的。
　　為了研究無poly(A)尾DHAV-1的增殖和毒力特點，將轉(zhuǎn)染后產(chǎn)物分別在BHK-21細胞及健康鴨胚中傳代20代，用3’RACE試劑盒分別檢測不同代次poly(A)的長度，并采用實時熒光定量PCR測定病毒拷貝數(shù)。試驗結(jié)果表明，無poly(A)尾的病毒基因組能夠組裝成完整的病毒粒子，并且可以在健康鴨胚和BHK-21細胞中增殖，但是與母本病毒相比，無poly(A)尾的DHAV-1具