增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）基因在日本血吸蟲體內(nèi)及原代培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)的異源表達(dá).pdf

1、目的：探討增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因在日本血吸蟲童蟲原代培養(yǎng)細(xì)胞、童蟲、成蟲體內(nèi)的異源表達(dá)，以及電穿法在血吸蟲基因轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。為轉(zhuǎn)基因血吸蟲研究奠定基礎(chǔ)。 方法：制備血吸蟲童蟲原代培養(yǎng)細(xì)胞，用脂質(zhì)體將EGFP基因?qū)肱囵B(yǎng)細(xì)胞內(nèi)并觀察其表達(dá)；然后應(yīng)用電穿孔技術(shù)將質(zhì)粒pEGFP-C1導(dǎo)入機(jī)械轉(zhuǎn)化的日本血吸蟲童蟲以及成蟲體內(nèi)，提取分離體外培養(yǎng)48h童蟲和成蟲的基因組DNA、總RNA和全蟲蛋白，分別用PCR、RT-PCR和We

2、sternblotting驗(yàn)證異源基因在童蟲和成蟲體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯，同時(shí)使用激光共聚焦掃描顯微鏡對(duì)EGFP在童蟲和成蟲體內(nèi)進(jìn)行定位。最后，將電穿孔后的童蟲肌肉注射至小鼠體內(nèi)確定其感染力。 結(jié)果：成功的觀察到表達(dá)EGFP基因的血吸蟲童蟲培養(yǎng)細(xì)胞；PCR和RT-PCR分別成功擴(kuò)增出760bp和276bp的預(yù)期大小的片斷；Westernblotting證實(shí)了EGFP基因在童蟲及成蟲體內(nèi)的表達(dá)；激光共聚焦掃描顯微鏡觀察顯示，EGFP主要