融合表達(dá)人白細(xì)胞介素-2（hIL-2）和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建.pdf

1、本研究的主要目的是構(gòu)建融合表達(dá)人白細(xì)胞介素-2(hlL-2)和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。首先設(shè)計(jì)合成一段150bp的接頭序列，將其插入載體pUC57的多克隆位點(diǎn)中，稱為pUC-MCS。酶切質(zhì)粒pUC-MCS和pRevTet-On后，分別回收目的片段進(jìn)行連接，將連接子轉(zhuǎn)化E.coli DH5a，篩選連接正確的質(zhì)粒，命名為pRev-MCS。對(duì)質(zhì)粒pRev-MCS和pEGFP-Cl進(jìn)行酶切，構(gòu)建重組質(zhì)pRevEGFP-C

2、1。同時(shí)對(duì)質(zhì)粒pBV220-IL-2和pEGFP-C1進(jìn)行酶切連接，重組為過渡質(zhì)粒pEGFP-Cl-IL-2。再分別酶切質(zhì)粒pRevEGFP-Cl和pEGFP-Cl-IL-2，連接重組為可融合表達(dá)IL-2和EGFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pRevEGFP-Cl-IL-2，經(jīng)酶切等檢測(cè)分析證明，構(gòu)建的載體pRevEGFP-Cl-IL-2完全符合設(shè)計(jì)方案。利用脂質(zhì)體Lipofectin將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞PT67中，經(jīng)G418選擇性培養(yǎng)液篩選

3、后得到具有G418抗性的PT67細(xì)胞克隆。將抗性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到能夠產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝細(xì)胞PT67／Cl-IL-2。取PT67／CL-IL-2細(xì)胞的培養(yǎng)上清，經(jīng)不同比例稀釋后感染NIH3T3細(xì)胞進(jìn)行滴定，測(cè)得重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的滴度為7X10<‘4> CFU／ml。進(jìn)一步取PT67／Cl-IL-2細(xì)胞的培養(yǎng)上清，感染MH3T3細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光。利用hIL-2 ELISA試劑盒檢測(cè)，經(jīng)感染的MH3T3細(xì)胞分