TRPC通道參與U-87細胞缺氧誘導(dǎo)的VEGF表達的研究.pdf

1、惡性多形性神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤（Glioblastoma multiforme，GBM）是最常見的惡性腦部腫瘤。GBM患者通常預(yù)后很差，是癌癥相關(guān)死亡的主要原因。這一類型腫瘤呈現(xiàn)高度血管依賴性。通常，神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性程度越高，則血管化程度越高。許多生長因子可以調(diào)節(jié)腫瘤血管生成，包括：成纖維細胞生長因子（Fibroblast growth factors，F(xiàn)GF），血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelia growth facto

2、rs，VEGF），內(nèi)皮生長因子（Endothelial growth factors，EGF）和轉(zhuǎn)化生長因子（Transforming growth factors，TGF-β）等。其中，VEGF是最重要的實體瘤血管生成因子。VEGF可促進血管內(nèi)皮細胞增殖，導(dǎo)致血管生成。缺氧是GBM的顯著特征，同時也是一個已知的可誘導(dǎo)VEGF表達的重要因素。人們發(fā)現(xiàn)，GBM壞死區(qū)周圍存在高度缺氧的區(qū)域（pseudopalisading region），

3、該區(qū)細胞表達高水平的VEGF。 VEGF表達的調(diào)節(jié)是復(fù)雜的，涉及到多個不同的水平，包括：VEGF轉(zhuǎn)錄增加，VEGF mRNA的穩(wěn)定，VEGF蛋白的分泌和擴散。在大多數(shù)細胞，缺氧誘導(dǎo)因子1α（Hypoxia inducible factor，HIF-1α）是調(diào)節(jié)VEGF表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。缺氧情況下，HIF-1α蛋白增加且轉(zhuǎn)錄活性升高。它與HIF-1β形成異源二聚體，與VEGF啟動子區(qū)結(jié)合，介導(dǎo)VEGF表達。 通常，轉(zhuǎn)錄

4、因子直接調(diào)控下游靶基因表達。然而，離子通道可能在更上游的水平發(fā)揮調(diào)節(jié)基因表達的作用。嗜鉻細胞瘤細胞系（PC12）是一個公認的可興奮的氧感受細胞；缺氧可以抑制氧敏感的鉀離子通道（Kvl.2），細胞因此產(chǎn)生去極化；Kvl.2的失活過程密切耦聯(lián)于HIF-1靶基因酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase）的表達。此外，非選擇性陽離子通道（non-selective cation channels）也參與缺氧信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。嚴重缺氧聯(lián)

5、合葡萄糖剝奪（prolonged oxygen and glucose deprivation）激活TRPM7-ROS正反饋通路，介導(dǎo)鈣超載事件，引起神經(jīng)元壞死。中等程度缺氧（1%）條件下，Yamaji等發(fā)現(xiàn)非選擇性陽離子通道參與缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞糖酵解甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）表達。缺氧暴露時，非選擇性陽離子通道被激活，通透鈣離子導(dǎo)致星形膠質(zhì)細胞胞內(nèi)鈣濃度升高，而鈣是重要的基因表達的調(diào)節(jié)者。 本研究主要關(guān)注TRPC離

6、子通道。TRPC通道是一個重要的TRP通道成員，可以感受多樣性的外界刺激。人類細胞表達六個TRPC亞型（TRPC1-7），除了TRPC2（在人類是假基因）。通過聯(lián)合使用藥理學以及細胞分子生物學方法，我們確認了一個特異性的TRPC亞型，TRPC1，參與缺氧誘導(dǎo)的U-87細胞VEGF表達。 目的: 本研究聯(lián)合使用多種細胞生物學和分子生物學方法：MTT，hoechst染色，real-time RT-PCR，western bl

7、ot，免疫熒光技術(shù)，RNA干擾，過表達，鈣濃度測定方法等，探討TRPC在缺氧誘導(dǎo)的U-87細胞VEGF表達中的作用。 方法: 1.通過MTT、Hoechst、western blot和real-time RT-PCR方法，分析低氧（1%O2）不同時間點細胞凋亡、增殖、缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）以及VEGF表達情況，以建立神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤細胞系U-87體外缺氧誘導(dǎo)VEGF表達的模型。 2.通過real-time

8、 RT-PCR，觀察TRPC通道阻斷劑SKF96365對缺氧誘導(dǎo)的VEGF表達的影響，以確定TRPC通道是否參與缺氧誘導(dǎo)的VEGF表達。 3.采用RT-PCR，檢測常氧情況下不同TRPC通道亞型在U-87細胞上的表達情況。 4.使用激光共聚焦顯微鏡，觀察加入TRPC通道激動劑OAG以及阻斷劑2-APB時細胞內(nèi)Ca2+的動態(tài)變化，以確定U-87細胞上的TRPC通道是否是功能性的。 5.使用real-time RT-

9、PCR，觀察并分析缺氧后TRPC通道各亞型的表達情況，以確定下一步需要使用的分子生物學策略：過表達或RNA干擾。 6.通過RNAi下調(diào)TRPC1表達。分別用real-time RT-PCR和ELISA檢測VEGF mRNA和蛋白水平的變化，觀察下調(diào)TRPC1對缺氧誘導(dǎo)的VEGF上調(diào)的影響。 7.通過瞬時轉(zhuǎn)染野生型TRPC3或TRPC5質(zhì)粒增加TRPC3或TRPC5表達。觀察TRPC3和TRPC5對缺氧誘導(dǎo)的VEGF表達的

10、影響。 8.通過免疫熒光技術(shù)，使用激光共聚焦顯微鏡觀察缺氧是否引起TRPC1胞內(nèi)轉(zhuǎn)位變化。 結(jié)果: 1.Hoechst結(jié)果顯示：缺氧（1% O2）24h或48h不導(dǎo)致細胞凋亡；缺氧24h僅輕微減少了細胞增殖（下降3.23%），而缺氧48h細胞出現(xiàn)明顯的增殖抑制（減少22.35%，P<0.001）；缺氧（1%O2）誘導(dǎo)HIF-1α增加；缺氧10h顯著誘導(dǎo)VEGF表達（升高4.24倍，P<0.01）。 2.T

11、RPC通道阻斷劑SKF96365可明顯抑制缺氧U-87細胞VEGF表達。25μM SKF96365抑制了VEGF mRNA水平的上調(diào)（P<0.01），且增加SKF96365的濃度進一步抑制VEGF表達。 3.常氧條件下，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，檢測到四個單一條帶，大小為168bp，112bp，119bp，159bp（與預(yù)期的產(chǎn)物大小一致），分別對應(yīng)于TRPC1，TRPC3，TRPC4和TRPC5亞型。 4.TRP

12、C通道激動劑OAG可增加胞內(nèi)Ca2+濃度，而TRPC通道阻斷劑2-APB可抑制激動劑誘導(dǎo)的胞內(nèi)Ca2+濃度增加。 5.缺氧后，U-87細胞TRPC3和TRPC4亞型表達分別減少67.7%，68.2%（P<0.05）。此外，高敏感的熒光定量PCR無法檢測到缺氧U-87細胞TRPC5亞型轉(zhuǎn)錄本。另一方面，常氧和缺氧膠質(zhì)瘤細胞TRPC1的表達保持穩(wěn)定，并不發(fā)生明顯減少。 6.化學合成的siRNA顯示出高度的細胞傳輸效率（超過9

13、0%）；三個TRPC1特異性的siRNAs：siRNA-1，siRNA-2和siRNA-3分別減少TRPC1 mRNA到64%，39%和36%（P<0.01）；分別減少TRPC1蛋白到陰性對照組的48%，29%和33%（P<0.01）。siRNA-2和siRNA-3顯著抑制了缺氧誘導(dǎo)的VEGF基因上調(diào)（P<0.01）。同時培養(yǎng)基中分泌的VEGF也發(fā)生類似的變化（P<0.01）。 7.通過瞬時過表達TRPC3或TRPC5增加了缺氧

14、情況下U-87細胞TRPC3或TRPC5的表達水平。但過表達這些TRPC野生型質(zhì)粒DNA既不促進缺氧U-87細胞VEGF表達，也不減弱VEGF表達（P>0.05）。 8.常氧條件下，TRPC1通道分布于胞膜及胞漿。然而缺氧后，胞漿區(qū)TRPC1熒光明顯減少，而細胞膜出現(xiàn)強烈的熒光信號。 結(jié)論: 1.1%O2是人體內(nèi)實體腫瘤低氧環(huán)境的氧氣濃度。體外的缺氧實驗證實該氧氣濃度作用24h不能誘導(dǎo)顯著的細胞凋亡且僅輕微抑制細

15、胞增殖，但延長缺氧暴露時間至48h可導(dǎo)致細胞增殖抑制。說明1%O2作用小于24h可能是合適的體外誘導(dǎo)U-87細胞VEGF表達的模型。進一步，缺氧（1%O2）可增加HIF-1α蛋白水平，并顯著誘導(dǎo)VEGF上調(diào)。 2.TRPC通道阻斷劑可抑制缺氧U-87細胞VEGF表達，說明TRPC通道可能參與缺氧誘導(dǎo)的VEGF表達。 3.常氧條件下，U-87細胞共表達四個TRPC通道亞型，分別為：TRPC1，TRPC3，TRPC4和TRP

16、C5。 4.對TRPC通道激動劑和阻斷劑的反應(yīng)性，說明U-87細胞上TRPC通道是功能性的。 5.缺氧后TRPC3，4，5亞型表達量顯著減少，而TRPC1表達保持不變。說明相對于其他TRPC亞型，TRPC1可能在膠質(zhì)瘤細胞缺氧信號通路中扮演不同的角色。并提示下一步針對缺氧抑制表達的TRPC亞型，可采用過表達方法；而針對TRPC1，則采用RNA干擾技術(shù)。 6.通過RNAi下調(diào)TRPC1表達可抑制缺氧誘導(dǎo)的VEGF基