血管內(nèi)皮細(xì)胞hCASK-Id1通路對(duì)p53表達(dá)調(diào)控的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景： 多臟器功能不全綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)是嚴(yán)重?zé)齻∪怂劳龅闹匾蛑?，它的發(fā)生和發(fā)展與燒傷嚴(yán)重程度、燒傷后休克期渡過(guò)是否平穩(wěn)以及燒傷感染有密切關(guān)系，提高燒傷的救治水平，必須重視MODS的防治。組織血液灌流不足及細(xì)胞缺血缺氧性損害是嚴(yán)重?zé)齻笈K器功能損害的病理生理基礎(chǔ)。燒傷后多種因素可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活和損傷，損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞使毛細(xì)血管通透性增加

2、，導(dǎo)致臟器間質(zhì)水腫，加重臟器的缺血缺氧性損害。同時(shí)，激活的血管內(nèi)皮細(xì)胞還可釋放大量的細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)，直接參與炎癥反應(yīng)、影響血管的收縮/舒張平衡、導(dǎo)致血液的高凝狀態(tài)、促進(jìn)中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。黏附的中性粒細(xì)胞可釋放多種炎癥介質(zhì)加重血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，使微循環(huán)功能障礙加重，進(jìn)一步減少重要臟器的血供和氧氣交換，最終導(dǎo)致多臟器功能不全綜合征?？梢哉f(shuō)，血管內(nèi)皮細(xì)胞活化與損傷是導(dǎo)致燒傷、創(chuàng)傷后器官功能障礙的中心環(huán)節(jié)之一。 內(nèi)皮

3、細(xì)胞的損傷早期表現(xiàn)為細(xì)胞活化，此時(shí)細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)參與全身的炎癥反應(yīng)。當(dāng)損傷因素得不到及時(shí)糾正時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞損傷加重，自血管壁剝脫、死亡，內(nèi)皮下膠原纖維暴露引發(fā)血管內(nèi)凝血，進(jìn)一步加重微循環(huán)障礙。微循環(huán)功能的恢復(fù)依賴血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的修復(fù)，因此，如何加速損傷內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)是燒傷后臟器功能障礙防治研究的重要內(nèi)容之一。 損傷修復(fù)過(guò)程涉及細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、黏附、通訊、增殖和分化，也包含細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)代謝基因的啟動(dòng)、調(diào)控等一系列

4、生化和分子生物學(xué)反應(yīng)。細(xì)胞的增殖反應(yīng)是其中重要環(huán)節(jié)之一，許多細(xì)胞因子及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與這個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，它們相互促進(jìn)、制約，共同發(fā)揮作用。如果能全面揭示細(xì)胞增殖調(diào)控的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，我們就可以主動(dòng)參與內(nèi)皮細(xì)胞損傷的修復(fù)進(jìn)程，在治療大面積燒創(chuàng)傷、防治內(nèi)臟并發(fā)癥時(shí)就可以掌握主動(dòng)權(quán)。 CASK是膜相關(guān)鳥(niǎo)苷酸激酶同源家族(membrane-associated guanylate kinasehomologs family，MAGuK)成員，

5、主要功能是作為腳手架蛋白質(zhì)(scaffold protein)，利用其多蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)合功能相關(guān)的蛋白分子，形成多蛋白復(fù)合物，參與許多重要的細(xì)胞生理過(guò)程。既往的研究通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)、免疫共沉淀和激光共聚焦等方法，在ECV-304細(xì)胞中證實(shí)了內(nèi)源性hCASK和Id1蛋白分子的相互作用：發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)hCASK的ECV-304細(xì)胞增殖緩慢，并且能誘導(dǎo)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p21、p16等表達(dá)上調(diào)，E蛋白家族成員(如E12、E417及HEB)參與了

6、這一信號(hào)調(diào)節(jié)過(guò)程，并由此提出hCASK-Id1通路抑制ECV-304細(xì)胞增殖的信號(hào)機(jī)制：hCASK通過(guò)與Id1結(jié)合，抑制Id1對(duì)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的負(fù)調(diào)控作用，促進(jìn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子(如E蛋白家族的E12、E47和HEB)與p21啟動(dòng)子E-box的結(jié)合，轉(zhuǎn)錄活化p21等基因，抑制細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換，抑制細(xì)胞增殖。 本組研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)表達(dá)hCASK可使p53表達(dá)升高，由于p53表達(dá)升高可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期導(dǎo)致細(xì)胞增殖功能的抑制，因此hC

7、ASK-Id1信號(hào)通路是否可以通過(guò)調(diào)控p53的表達(dá)發(fā)揮細(xì)胞增殖抑制的功能值得進(jìn)一步研究。 研究目的： 本研究的重點(diǎn)是考察hCASK-Id1信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞增殖的機(jī)制，探討hCASK-Id1通路是否可通過(guò)影響p53表達(dá)發(fā)揮其在細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)中的調(diào)控作用，并初步探討該通路調(diào)節(jié)p53表達(dá)的機(jī)制。 研究方法： 1.采用RNA干擾技術(shù)(RNAi)，應(yīng)用質(zhì)粒載體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)小干擾RNA(siRNA)表達(dá)策略，將針對(duì)CA

8、SK的RNA干擾質(zhì)粒pGenesil-1-hCASK轉(zhuǎn)染ECV-304細(xì)胞，篩選并建立CASK抑制表達(dá)細(xì)胞株，采用MTT、流式細(xì)胞技術(shù)和Western Blot印跡技術(shù)研究其對(duì)細(xì)胞增殖功能及p53表達(dá)的影響。 2.構(gòu)建Id1強(qiáng)制表達(dá)載體plRES2-EGFP-Id1，轉(zhuǎn)染ECV-304細(xì)胞，篩選并建立了Id1強(qiáng)制表達(dá)細(xì)胞株，用MTT、流式細(xì)胞技術(shù)和Western Blot印跡技術(shù)分析其對(duì)細(xì)胞增殖及p53表達(dá)的影響。 3.

9、構(gòu)建針對(duì)p53基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因載體，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建含p53基因啟動(dòng)子不同截短片段的載體，了解在p53基因啟動(dòng)子上起主要作用的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域，為深入研究hCASK-Id1通路影響p53表達(dá)的信號(hào)機(jī)制提供信息。 結(jié)果： 1.RNA干擾對(duì)于hCASK的抑制率與其作用位點(diǎn)直接相關(guān)，本研究中2號(hào)靶點(diǎn)的抑制率約70％，而1號(hào)靶點(diǎn)幾乎沒(méi)有明顯的抑制效果。hCASK抑制表達(dá)可以使ECV-304細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線左移，促進(jìn)細(xì)胞

10、增殖，細(xì)胞周期分析也發(fā)現(xiàn)抑制hCASK表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞群中G2M+S期細(xì)胞比率升高，是細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)的表現(xiàn)。 2.通過(guò)克隆Id1全長(zhǎng)編碼基因，成功的構(gòu)建了Id1真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染ECV-304細(xì)胞，經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定Id1強(qiáng)制表達(dá)的細(xì)胞亞系。在所得到的ECV-304-Id1(+)細(xì)胞株中，轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞比率達(dá)到90％以上，為今后深入研究hCASK-Id1通路功能奠定了基礎(chǔ)。Id1的強(qiáng)制表達(dá)可以使細(xì)胞增殖曲線左移，細(xì)胞群中G2M

11、+S期細(xì)胞比率升高，促進(jìn)細(xì)胞增殖。 3.Western Blot印跡實(shí)驗(yàn)表明hCASK抑制表達(dá)和Id1強(qiáng)制表達(dá)均可使p53蛋白的表達(dá)下降。 4.成功構(gòu)建含p53基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，同未轉(zhuǎn)染ECV-304細(xì)胞相比，hCASK抑制表達(dá)細(xì)胞株和Id1強(qiáng)制表達(dá)細(xì)胞株都能使p53基因啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)?；钚越档?，提示hCASK、Id1對(duì)p53表達(dá)的調(diào)節(jié)至少部分是通過(guò)影響p53基因轉(zhuǎn)錄水平造成的。 5.構(gòu)建了系列

12、截短的p53基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒。通過(guò)將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hCASK抑制表達(dá)和Id1強(qiáng)制表達(dá)細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)p53基因啟動(dòng)子3’端約150bp的序列(從-150到-1)是激活p53基因表達(dá)必須的，在這段序列中，包含了E-box、Ets、AP-2、HIF-1、HES1、Sum1等潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。 6.將Id1強(qiáng)制表達(dá)和抑制表達(dá)質(zhì)粒與PGL3-p53p-luc共轉(zhuǎn)染己篩選出的CASK抑制表達(dá)細(xì)胞株，檢測(cè)Id1表達(dá)變化對(duì)p53

13、基因啟動(dòng)子活性的影響，結(jié)果Id1抑制可使p53基因啟動(dòng)子活性較hCASK抑制表達(dá)細(xì)胞株升高，而Id1強(qiáng)制表達(dá)可使hCASK抑制表達(dá)細(xì)胞p53基因啟動(dòng)子的活性進(jìn)一步下降。 結(jié)論： 1.hCASK抑制表達(dá)及Id1強(qiáng)制表達(dá)均可促進(jìn)細(xì)胞增殖、下調(diào)p53蛋白表達(dá)。 2.hCASK-Id1通路對(duì)p53蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)至少部分是在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮的，p53基因啟動(dòng)子3’端約150bp的序列(從-150到-1)是激活p53基因表達(dá)必須