肝細(xì)胞癌患者石蠟包埋肝組織HBVcccDNA的原位檢測.pdf

1、目的:原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)是一種常見的高度惡性腫瘤,其發(fā)病率位居我國癌癥發(fā)病率的第二位。流行病學(xué)證實(shí)乙肝病毒(HBV)的感染是HCC發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)是HBV生命周期中重要的復(fù)制中間體,是乙型肝炎病毒前基因組RNA(pgRNA)的原始合成模板,已經(jīng)被公認(rèn)為HBV持續(xù)感染和肝臟進(jìn)行性病理改變的根本原因。體外試驗(yàn)及動(dòng)物試驗(yàn)研究均提示HBV cccDNA與肝細(xì)胞癌變的發(fā)生密切相關(guān)。目前,肝組織內(nèi)HBV

2、cccDNA的定量檢測方法隨著PCR技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用已日趨成熟,而人肝癌組織內(nèi)HBVcccDNA的定位檢測研究,國內(nèi)外鮮見報(bào)道。本研究通過一種新型的原位檢測方法,檢測HCC患者癌及癌旁組織中HBV cccDNA的表達(dá),探討其在HCC中的意義,為臨床上原發(fā)性肝細(xì)胞癌的預(yù)防和治療提供新的理論根據(jù)。
　　方法:收集20例北京302醫(yī)院2011年9月-2012年9月期間住院的HCC患者癌及癌旁組織手術(shù)切除標(biāo)本,經(jīng)10％中性福爾馬林固定,石

3、蠟包埋,5μm連續(xù)切片后使用。采用不降解質(zhì)粒的ATP依賴的DNA(PSAD)酶消除松弛的環(huán)狀HBVDNA(rcDNA)后,根據(jù)我國常見的HBV基因型B、C基因組全序列,設(shè)計(jì)引物4對(duì),應(yīng)用原位滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)的方法只擴(kuò)增環(huán)狀的DNA,再采用針對(duì)HBV cccDNA與HBVrcDNA結(jié)構(gòu)上的差異所設(shè)計(jì)的5端地高辛標(biāo)記的特異性引物進(jìn)行直接原位跨缺口PCR,進(jìn)一步擴(kuò)增HBV cccDNA。通過免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行顯色,在顯微鏡下觀察HBV c

4、ccDNA在肝組織中表達(dá)及分布。以肝癌患者肝組織為例,設(shè)置無引物、無地高辛標(biāo)記引物、無Phi29酶和DNA聚合酶反應(yīng)體系,以及非乙型肝炎病毒感染肝組織(包括健康成人肝組織5例,轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織2例,丙型肝炎患者肝組織3例)作為陰性對(duì)照組。
　　結(jié)果:20例肝細(xì)胞癌患者肝組織標(biāo)本中有17例(85%)檢測到HBV cccDNA陽性信號(hào),為紫紅色或紫藍(lán)色呈團(tuán)塊狀,定位于細(xì)胞核。肝癌患者癌組織及癌旁組織HBV cccDNA陽性率分別為10