NOS抑制劑對(duì)METH神經(jīng)毒性的保護(hù)作用及GSTP1過表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、背景:
　　 近年來，新型毒品種類不斷增多，為毒品的防治提出新的課題和挑戰(zhàn)。甲基苯丙胺(Methamphetamine，METH or MA)俗稱“冰毒”，屬于苯丙胺類興奮劑，是最具代表性的和最常見新型毒品。因其具有見效快、興奮作用維持時(shí)間長(zhǎng)，價(jià)格低廉，化學(xué)合成技術(shù)簡(jiǎn)單，多途徑攝取等特點(diǎn)，使它濫用及蔓延速度極快，成為當(dāng)今我國(guó)危害最為嚴(yán)重和濫用的兩大毒品之一。
　　 法醫(yī)在接觸因吸食冰毒死亡或與吸毒有關(guān)的其它暴力死亡的尸檢

2、和在戒毒所治療的病人過程中，發(fā)現(xiàn)其死亡與心腦重要器官及其血管的代謝損傷相關(guān)。有大量的資料表明，冰毒對(duì)大腦神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生直接的損害作用，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)化學(xué)、神經(jīng)病理改變，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死和異常的膜性結(jié)構(gòu)改變，出現(xiàn)急性和慢性精神障礙和行為改變;可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大、萎縮、變性、收縮帶壞死、小血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和小血管痙攣，從而導(dǎo)致急性心肌缺血、心肌病和心律失常，成為吸毒者突然死亡的原因。因此，對(duì)冰毒吸食者毒性損傷機(jī)制乃至成癮機(jī)制及猝

3、死機(jī)制的研究和探索成為國(guó)內(nèi)外法醫(yī)關(guān)注的問題，也是本實(shí)驗(yàn)室近十年來的重點(diǎn)研究方向。
　　 目前，關(guān)于METH的神經(jīng)毒性機(jī)制國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果尚未完全明確，現(xiàn)階段的研究結(jié)果顯示多種機(jī)制參與了METH的神經(jīng)毒性，主要包括氧化應(yīng)激、神經(jīng)元凋亡、興奮性毒性、線粒體功能障礙等，其中氧化應(yīng)激是METH所致神經(jīng)毒性損傷的重要機(jī)制作用之一。
　　 本實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，對(duì)METH注射后大鼠紋狀體、額葉皮質(zhì)、海馬等部位的差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)

4、行鑒定和分析，發(fā)現(xiàn)了一種新型的NO合成調(diào)節(jié)酶二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1(DDAH1)表達(dá)上調(diào)，提出了DDAH/ADMA/NOS系統(tǒng)可能是NO過表達(dá)引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的重要途徑。本課題組前期研究應(yīng)用穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(SILAC)，對(duì)METH作用后PC12細(xì)胞進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶蛋白(GSTP1)硝基化增強(qiáng)，提出了GSTP1-P35/P25-CdK5可能是氧化應(yīng)激損傷的重要調(diào)節(jié)途徑。
　　 本研究

5、擬建立METH中毒細(xì)胞模型和動(dòng)物模型，通過形態(tài)學(xué)、NOS含量、DA含量及凋亡等指標(biāo)的檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證METH引起的中樞性毒害作用，并通過給予NOS抑制劑（L-NAME和7-NI）反證氧化應(yīng)激過程中NOS在METH中毒模型中的作用及其與METH神經(jīng)毒性的關(guān)系，進(jìn)一步完善DDAH1/ADMA/NOS通路的神經(jīng)毒性作用機(jī)制，并為研究GSTP1-P35/P25-CDK5這一可能的NO氧化應(yīng)激下游通路的提供依據(jù)。
　　 本研究擬利用體外研

6、究手段，通過腺病毒載體在PC12細(xì)胞上建立GSTP1過表達(dá)模型，通過調(diào)控GSTP1表達(dá)，研究其基因水平的改變對(duì)METH氧化應(yīng)激過程中上述通路的調(diào)控變化及作用，探索其是否是介導(dǎo)氧化應(yīng)激致細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)損傷和細(xì)胞凋亡死亡通路的中間環(huán)節(jié)。本研究預(yù)期結(jié)果不僅為闡明METH的毒性損傷作用機(jī)制提供基礎(chǔ)，也為METH中毒的防治、METH戒毒藥物靶點(diǎn)的選擇乃至為毒品戒斷治療奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究還將應(yīng)用mRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)，檢測(cè)METH作用P

7、C12細(xì)胞引起的全基因mRNA的變化，以期篩選出差異表達(dá)mRNA，以明確差異表達(dá)mRNA和METH神經(jīng)毒性之間的關(guān)系，為今后的METH神經(jīng)毒性機(jī)制研究提供新的研究靶點(diǎn)。
　　 目的:
　　 建立METH中毒細(xì)胞模型和動(dòng)物模型，并給予NOS抑制劑，通過形態(tài)學(xué)、NOS含量、DA含量及凋亡等指標(biāo)的檢測(cè)，驗(yàn)證氧化應(yīng)激過程中NOS的作用及其與METH神經(jīng)毒性的關(guān)系;通過腺病毒載體在PC12細(xì)胞上建立GSTP1過表達(dá)模型，進(jìn)而研究G

8、STP1在METH氧化應(yīng)激過程中的作用;應(yīng)用mRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)，明確差異表達(dá)mRNA和METH神經(jīng)毒性之間的關(guān)系，為METH神經(jīng)毒性機(jī)制研究提供新的研究靶點(diǎn)。
　　 方法:
　　 1.METH中毒模型的建立及NO抑制劑的保護(hù)作用
　　 1.1 METH中毒動(dòng)物模型的建立及7-NI的保護(hù)作用SD大鼠雄性24只，隨機(jī)分為四組，每組6只:生理鹽水組、METH組、METH+7-NI組、7-NI組。動(dòng)物單籠飼養(yǎng)，自由飲

9、水、取食。實(shí)驗(yàn)前先在飼養(yǎng)室適應(yīng)3天。第一組（生理鹽水組）:腹腔注射生理鹽水，早8:30、晚5:00各一次，連續(xù)注射3天;第二組（METH組）:腹腔注射METH，早8:30、晚5:00各一次，連續(xù)注射3天;第三組（METH+7-NI組）:注射方法同第二組，提前30min在腹腔注射7-NI;第四組（7-NI組）:注射方法同第一組，提前30 min腹腔注射7-NI，腹腔注射生理鹽水。制成動(dòng)物模型后，觀察行為學(xué)變化情況，對(duì)大鼠的刻板行為進(jìn)行評(píng)分

10、。應(yīng)用western blot檢測(cè)大鼠紋狀體nNOS表達(dá)、ELISA法檢測(cè)紋狀體多巴胺含量、應(yīng)用Tunel熒光法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　 1.2 METH中毒細(xì)胞模型的建立及L-NAME的保護(hù)作用已分化的PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含10％FBS、雙抗(1∶100)的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。PC12細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，達(dá)約80％匯合時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（陰性對(duì)照）和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組根據(jù)L-NAME(N

11、-硝基-L-精氨酸甲酯)濃度的不同而分為5組，各組METH含量均為2.0 mmol/L，L-NAME含量分別為0μmol/L（陽性對(duì)照）、1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80％匯合時(shí)，倒去原培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入含上述濃度METH和L-NAME的無血清培養(yǎng)基，對(duì)照組換成等體積不含血清和METH的培養(yǎng)基，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后。倒置顯微鏡下觀察PC12細(xì)胞形態(tài)改變，PE Annexin試劑盒、

12、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，NOS檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞總NOS活力，Western blot技術(shù)檢測(cè)GSTP1表達(dá)變化。
　　 2.GSTP1過表達(dá)載體的構(gòu)建首先通過PCR擴(kuò)增大鼠全長(zhǎng)GSTP1 cDNA序列，然后將PCR產(chǎn)物與pshuttle-IRES-hrGFP-1體外重組并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測(cè)序驗(yàn)證。然后又將穿梭質(zhì)粒pshuttle-GSTP1與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1重組。通過Lipo2000介導(dǎo)將重組體腺病毒在AD29

13、3細(xì)胞中的包裝擴(kuò)增。最后通過qPCR和western blotting驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。
　　 3.PC12細(xì)胞METH毒性損傷mRNA表達(dá)譜的差異分析及驗(yàn)證按照前述方法進(jìn)行培養(yǎng)PC12細(xì)胞并進(jìn)行藥物處理，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（陰性對(duì)照）和METH組，METH+L-NAME組。METH濃度為2.0mmol/L，L-NAME濃度100μmol/L當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80％匯合時(shí)，倒去原培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入含上述濃度METH和L-NAME的無血清培

14、養(yǎng)基，對(duì)照組換成等體積不含血清和METH的培養(yǎng)基，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后。將待檢樣品抽提RNA后進(jìn)行mRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)。
　　 結(jié)果:
　　 1.METH中毒模型的建立及NO抑制劑的保護(hù)作用
　　 1.1 動(dòng)物模型的建立及7-NI的保護(hù)作用本實(shí)驗(yàn)METH組和7Ni+METH組的動(dòng)物刻板行為評(píng)分均顯著高于7Ni和Control組（P均＜0.001），METH、7Ni+METH組間無顯著性差別(P=0.769)，7

15、Ni、Control組間無顯著性差別(P=0.190)。Western blot結(jié)果顯示METH組大鼠紋狀體中nNOS蛋白表達(dá)水平明顯升高，而METH+7-NI組nNOS表達(dá)水平較METH組明顯降低。ELISA結(jié)果顯示METH組DA顯著降低(P＜0.001)，而METH+L-NAME組、L-NAME組與對(duì)照組比較，DA無顯著差異(P＞0.01)。采用Tunel法檢測(cè)各組大鼠腦組織紋狀體內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，METH組與對(duì)照組相比凋亡細(xì)胞數(shù)

16、顯著升高(P＜0.001)，而7-NI對(duì)凋亡的增高表現(xiàn)出明顯的保護(hù)作用（與METH組相比P＜0.001）。
　　 1.2 細(xì)胞模型的建立及L-NAME的保護(hù)作用結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組細(xì)胞相比，METH處理的細(xì)胞萎縮變圓，變圓細(xì)胞的胞質(zhì)透亮度增加，可見環(huán)形透亮區(qū)，突起變短、斷裂、消失，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)消失，因細(xì)胞突起萎縮可在細(xì)胞表面形成毛刺狀，邊界不清晰。加入L-NAME處理后，細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變隨濃度升高損傷呈減弱趨勢(shì)，中、高濃度處理主要

17、主要以胞體變圓及胞漿透亮增加為主，突起無明顯改變。METH處理后細(xì)胞凋亡率顯著增加，加入L-NAME后細(xì)胞總凋亡率隨著濃度增加逐漸減少，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P＜0.001)，尤其是中、高濃度L-NAME具有顯著的抑制細(xì)胞凋亡作用。METH作用后PC12細(xì)胞內(nèi)總NOS活性增加，加入L-NAME后NOS活力逐漸下降，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.02)。同時(shí)采用western-blot技術(shù)對(duì)細(xì)胞內(nèi)GSTP1表達(dá)變

18、化進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)METH處理PC12細(xì)胞GSTP1水平顯著下降，加入L-NAME后對(duì)GSPT1蛋白的下降趨勢(shì)可起到明顯的抑制作用:隨L-NAME濃度的升高，GSTP1蛋白的表達(dá)逐漸上升，并出現(xiàn)接近正常水平的趨勢(shì)。
　　 2.GSTP1過表達(dá)載體的構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)通過脂糖凝膠電泳跑膠，證明了攜帶GSTP1序列穿梭載體構(gòu)建成功，在Ad-293細(xì)胞中觀察到綠色熒光的表達(dá)證明病毒在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行包裝，綠色熒光在PC12細(xì)胞中大面積的出現(xiàn)，顯示

19、pAdEasy-1重組腺病毒在PC12細(xì)胞中成功表達(dá)。qPCR以及western blotting的結(jié)果顯示腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1重組的轉(zhuǎn)染效率高。
　　 3.METH作用下大鼠腦組織mRNA表達(dá)譜的差異分析本實(shí)驗(yàn)通過9張芯片比較正常對(duì)照組與METH組、METH+L-NAME組三組間的差異表達(dá)mRNA，結(jié)果表明METH可導(dǎo)致184個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，518個(gè)基因表達(dá)下調(diào);而NOS抑制劑L-NAME可對(duì)其中的470下調(diào)基因和

20、2個(gè)上調(diào)基因發(fā)生有效的保護(hù)作用，約占全部差異基因的67.24％。METH組與正常對(duì)照組之間差異表達(dá)的基因中，我們發(fā)現(xiàn)與凋亡相關(guān)的基因有16個(gè)。
　　 結(jié)論:
　　 1.在大鼠動(dòng)物模型上，METH明顯增加大鼠不自主的刻板運(yùn)動(dòng)，而應(yīng)用7-NI預(yù)處理后，對(duì)刻板行為也無明顯改善。METH可導(dǎo)致nNOS蛋白表達(dá)水平增高、DA含量的降低及細(xì)胞凋亡增多等多種神經(jīng)毒性表現(xiàn)，nNOS特異抑制劑7-NI能部分減輕其神經(jīng)毒性作用。這些結(jié)果為下

21、一階段應(yīng)用此動(dòng)物模型進(jìn)一步研究NOS下游通路的作用機(jī)制奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　 2.L-NAME對(duì)METH導(dǎo)致的神經(jīng)毒性損傷作用具有保護(hù)作用，能減弱細(xì)胞形態(tài)學(xué)損傷、抑制凋亡、增加GSTP1表達(dá)水平，通過阻斷氧化應(yīng)激的上游信號(hào)NOS活性發(fā)揮抗氧化、抗凋亡作用。中、高濃度L-NAME可用于METH神經(jīng)毒性損傷保護(hù)機(jī)制的研究。
　　 3.證明了攜帶GSTP1序列穿梭載體構(gòu)建成功，在Ad-293細(xì)胞中觀察到綠色熒光的表達(dá)，證明病

22、毒在細(xì)胞進(jìn)行包裝，轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)綠色熒光，證明轉(zhuǎn)染成功。經(jīng)過qPCR以及western blotting的結(jié)果顯示腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1重組的轉(zhuǎn)染效率高。以上證明了GSTP1過表達(dá)載體的構(gòu)建成功。為下一步研究GSTP1下游調(diào)控基因提供可靠的細(xì)胞模型。
　　 4.mRNA表達(dá)譜經(jīng)過GO分析，差異表達(dá)的基因主要參與的生物過程有核糖體合成、炎癥反應(yīng)、抗凋亡的正向調(diào)節(jié)、過氧化氫代謝、線粒體電子傳遞泛醌-細(xì)胞色素C、氧化

23、應(yīng)激反應(yīng)、線粒體鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)、多巴胺能突觸傳遞負(fù)向調(diào)節(jié)、過氧化氫反應(yīng)、凋亡的正向調(diào)節(jié)、線粒體電子傳遞細(xì)胞色素C氧化、通過細(xì)胞色素C的caspase的活化、高熱反應(yīng)等。Pathway分析顯示，METH組與正常對(duì)照組相比，差異基因主要參與了Alzheimer's disease、Parkinson's disease、糖酵解/糖異生、核糖體、氧化磷酸化、P53信號(hào)通路、凋亡、自然殺手細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、鈣信號(hào)通路等信號(hào)