C57BL-6小鼠CIA模型建立方法的改進及CIA小鼠脾淋巴細(xì)胞Th1與Th2的動態(tài)觀察.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性、炎癥性、組織特異性自身免疫性疾病,發(fā)病機制非常復(fù)雜,至今尚未完全闡明。有研究顯示可能是由于自身性免疫障礙導(dǎo)致免疫系統(tǒng)持續(xù)攻擊關(guān)節(jié)組織造成長期慢性炎癥。盡管已經(jīng)證實多種細(xì)胞和分子參與了關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)和組織破壞,但抗原特異性T細(xì)胞的激活始終被認(rèn)為是RA發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。T細(xì)胞主要是通過細(xì)胞間的作用及其分泌的細(xì)胞因子在RA的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。CD4+T細(xì)胞作為效應(yīng)

2、 T細(xì)胞的重要成分,參與免疫應(yīng)答的各個階段,在免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用,是細(xì)胞免疫的核心和樞紐。目前較為公認(rèn)的觀點是:RA是抗原呈遞細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞作用的結(jié)果。隨著近年對CD4+T細(xì)胞在RA中的作用研究不斷深入,為深化對RA發(fā)病機制的了解,拓展治療RA新思路,尋找新的治療靶點提供了新的理論與實驗依據(jù)。
　　本研究在改進CIA小鼠模型的研究基礎(chǔ)上,以膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠(CIA)為研究對象,通過對CIA模型小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞亞群

3、Th1和Th2細(xì)胞在不同疾病發(fā)展時期占 CD4+T細(xì)胞百分比的變化規(guī)律以及小鼠血清中細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α動態(tài)觀察,進一步闡明CD4+T細(xì)胞在 RA疾病的發(fā)生發(fā)展中的作用,為揭示類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。
　　第一部分C57BL/6小鼠CIA模型建立方法的改進
　　目的:建立穩(wěn)定的C57BL/6小鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(CIA)模型,為進一步進行類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)發(fā)病機制及治療研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:

4、
　　1.健康清潔級C57BL/6小鼠100只,隨機取20只做正常對照組,其余80只小鼠隨機分為4組:常規(guī)方法組:CⅡ與FCA等比例混合物免疫動物;卡介苗低劑量組、中劑量組和高劑量組,分別在CⅡ與FCA等比例混合物中加上卡介苗2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml免疫動物。以各組小鼠AI評分判斷模型是否成功。
　　2.病理學(xué)觀察:加強免疫35天脫頸處死小鼠,除去病變關(guān)節(jié)的皮毛和多余的皮下組織,保留跖趾關(guān)節(jié)及趾間關(guān)節(jié),

5、4％多聚甲醛固定,10%EDTA脫鈣,常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片。HE染色,顯微鏡下觀察。
　　3.關(guān)節(jié)影像學(xué)觀察:于加強免疫49天,鉬靶 X線機對小鼠踝、足關(guān)節(jié)拍片,進行影像學(xué)檢查和分析。
　　4.脾臟的大體觀察及脾指數(shù)測定:取處死后的小鼠脾臟進行大體觀察、稱重,計算脾指數(shù)并與正常對照組進行比較。
　　結(jié)果:
　　1.各組小鼠造模成功率的比較及小鼠疾病發(fā)展過程中不同時間點關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)評分
　　卡介苗低

6、劑量組與中劑量組成模率高于常規(guī)方法組(P<0.01),但卡介苗低劑量組與中劑量組成模率比較差別無統(tǒng)計學(xué)意義。小鼠加強免疫后3d逐漸出現(xiàn)足趾部及踝關(guān)節(jié)皮膚發(fā)紅,輕度腫脹等關(guān)節(jié)炎癥狀。以低劑量組為例分別于加強免疫3d,7d,10d,12d,14d,21d,28d,35d檢測各組小鼠AI評分,CIA模型組小鼠AI值在不同時間點與正常對照組相比均有顯著性差異(P<0.01)?？ń槊绺邉┝拷M動物死亡率達到80%,未作統(tǒng)計。
　　2.關(guān)節(jié)組織

7、病理學(xué)研究
　　與正常對照組相比,模型組小鼠(加強免疫35d)病變關(guān)節(jié)骨質(zhì)和軟骨組織破壞,滑膜組織增厚,血管新生增多,大量炎癥細(xì)胞侵潤。
　　3.關(guān)節(jié)影像學(xué)檢查
　　影像學(xué)檢查顯示病變關(guān)節(jié)組織畸形,關(guān)節(jié)間隙變窄,關(guān)節(jié)面不光滑,骨膜內(nèi)有新骨形成。
　　4.免疫后小鼠脾臟的變化
　　加強免疫后35d小鼠脾臟體積增大,顏色發(fā)黑。脾指數(shù)與正常對照組比較均顯著增加(P<0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.在

8、常規(guī)造模方法的基礎(chǔ)上按照2.5mg/ml的劑量加入卡介苗可有效增加 CIA小鼠模型的成模率。低劑量組與中劑量組成模率比較差別無統(tǒng)計學(xué)意義。低劑量組 CIA模型小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)在加強免疫3d,7d,10d,12d,14d,21d,28d,35d各時間點均高于正常對照組。
　　2.通過關(guān)節(jié)炎指數(shù)及影像學(xué)、病理組織學(xué)等觀察,證明按照改良的造模方法,能夠建立比較好的CIA模型。
　　第二部分CIA小鼠脾淋巴細(xì)胞Th1與Th2的

9、動態(tài)觀察
　　目的:
　　探討CD4+T細(xì)胞Thl和Th2在CIA小鼠模型中的動態(tài)變化規(guī)律。
　　方法:
　　1.HE染色觀察模型鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化情況。
　　2.分析天平稱重法測定小鼠脾臟重量并計算其指數(shù)。
　　3.應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測脾淋巴細(xì)胞Th1和Th2的變化情況。
　　4.Flowcytomix法檢測小鼠血清IFN-γ、TNF-α水平。
　　結(jié)果:
　　1.加強免疫后7d、

10、14d和35d小鼠膝關(guān)節(jié)切片HE染色均有不同程度的骨組織和軟骨質(zhì)破壞,滑膜組織增厚,血管新生增多和炎癥細(xì)胞侵潤。
　　2.加強免疫后7d、14d和35d各時間點間脾指數(shù)差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);模型組三個時間點脾指數(shù)均高于正常組,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　3.各時間點脾淋巴細(xì)胞Th1和Th2的分化水平
　　加強免疫后7d、14d和35d CD4+IFN-γ+細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分率均高于正常對照

11、組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。且加強免疫后7d,和14d與加強免疫后35d比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。加強免疫后7d、14d和35d CD4+IL-4+細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分率與對照組比較差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　4.各時間點血清IFN-γ和TNF-α的水平
　　加強免疫后7d、14d、35d各時間點血清IFN-γ均高于正常對照組(P<0.01),且呈逐漸下降趨勢。TNF-α只在加強免疫后