β-硫基乙醇和堿性成纖維細胞生長因子體外誘導骨髓間充質(zhì)干細胞分化神經(jīng)元細胞的實驗研究.pdf

1、目的：⑴大鼠骨髓間質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)特性，探討MSCs的體外分離、培養(yǎng)、擴增的規(guī)律和特點。建立SD大鼠骨髓間充質(zhì)于細胞體外培養(yǎng)體系。⑵采用β-硫基乙醇（β-ME）和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）作為誘導劑，對骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSC）進行體外誘導實驗。探討β-ME和bFGF體外誘導骨髓間充質(zhì)干細胞分化神經(jīng)元細胞的機制，為脊髓損傷的細胞移植治療提供實驗基礎(chǔ)。 方法：①取一月齡SD大鼠股骨和脛骨，采用全骨髓培養(yǎng)法，以L-DMEM

2、完全培養(yǎng)基沖出骨髓過濾后直接接種于培養(yǎng)瓶中，3天后首次換液，以后每3天換液一次。至細胞融合達80％以上時，進行傳代。②取第1、4、7、10、13代細胞，觀察其細胞生長曲線及貼壁率。③取第4代細胞，采用流式細胞儀檢測。④取P4代的rBMSC，以2×104/ml濃度接種于24孔板內(nèi)，待細胞達到70％～80％融合時，分別加入β-硫基乙醇（β-ME）和堿性成纖維細胞生長因子（bFGF），倒置相差顯微鏡下連續(xù)觀察細胞形態(tài)變化。⑤采用細胞免疫熒光方

3、法，對以上兩組細胞誘導后5h后檢測神經(jīng)元標志物TuJ1和星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP的表達情況，熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。⑥熒光顯微鏡下在各組細胞隨機取300個細胞，計數(shù)TuJ1反應(yīng)陽性細胞個數(shù)，檢驗各組不同時間點的差異，以及每個時間點各組間的差異。統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)均以x±s表示，并用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。⑦免疫印跡法（Western blotting）檢測分化細胞的特異性標志物分別取誘導分化后0h，1h，5h后的細胞，

4、使用2X SDS sample buffer裂解細胞，進行神經(jīng)元特異性蛋白TuJ-1和星形膠質(zhì)細胞特異性蛋白GFAP的定量分析。 結(jié)果：⑴貼壁篩選法，通過多次換液可以分離、純化BMSC，該法簡單、方便、效果好。⑵BMSC在體外培養(yǎng)中有很強的增殖能力，10代以前的細胞形態(tài)較一致，增殖能力強，隨傳代次數(shù)的增加，增殖能力減弱，形態(tài)發(fā)生不規(guī)則變化。細胞生長的第1、4、7、10、13代的貼壁率變化規(guī)律基本相同，無顯著區(qū)別。傳代后細胞貼壁率

5、隨時間延長而增高。⑶rBMSC的表面標志抗原呈現(xiàn)多樣性的特征，rBMSC不表達造血細胞表面抗原CD34、CD45，說明rBMSC非造血類細胞；而其表達CD90、CD44，說明rBMSC的表面標志具有非單一性的特性。它表達了間質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞和表皮細胞的表面標志。⑷第4代rBMSC加入誘導劑后可分化為神經(jīng)元細胞和星形膠質(zhì)細胞。可見光下觀察：前者細胞體積較小數(shù)量較少，常有數(shù)個短小突起和一個較長的突起，呈典型的雙極、多極或錐形，具有較強的折光

6、性；后者細胞體積較大，細胞突起較多且粗，有些形態(tài)呈星狀，有許多突起呈放射狀伸出，平鋪在培養(yǎng)皿上。⑸細胞免疫熒光結(jié)果示細胞誘導后5h，部分細胞TuJ1反應(yīng)陽性，為神經(jīng)元細胞；部分細胞GFAP反應(yīng)陽性，為星形膠質(zhì)細胞。⑹rBMSC誘導為神經(jīng)元細胞陽性率比較，經(jīng)統(tǒng)計學分析，誘導后β-ME組1h，5h分化率最高，24h bFGF組分化率最高，與其它組有顯著差異（P<0.01）；β-ME組在誘導24h后多數(shù)細胞已死亡，無法統(tǒng)計。β-ME組1h與5

7、h的分化率有顯著差異（P<0.01）；bFGF組5h和24h的分化率與1h的分化率有顯著差異（P<0.01），但5h和24 h的分化率無顯著差異（P>0.05）。⑺Western Blotting檢測結(jié)果顯示，在上樣20ug總蛋白，隨著誘導時間的延長，rBMSC誘導分化后，表達TUJ-1和GFAP的量明顯增加。并且，隨著誘導時間的延長干細胞分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的數(shù)量增多。 結(jié)論：①本實驗采用骨髓直接培養(yǎng)法來分離培養(yǎng)BMSC