白肋型煙草葉色基因的分子標(biāo)記與煙草種質(zhì)遺傳多樣性研究.pdf

1、煙草是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，在世界上許多國(guó)家廣為栽培。煙草自明朝傳入我國(guó)后，歷經(jīng)四百多年的栽培，產(chǎn)生了豐富的種質(zhì)資源，加上從國(guó)外引進(jìn)的種質(zhì)，目前我國(guó)已擁有煙草種質(zhì)資源4042份，居世界領(lǐng)先水平。開(kāi)展煙草種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究，將更好地促進(jìn)煙草種質(zhì)資源的收集、保存、鑒定、創(chuàng)新和有效利用。 分子標(biāo)記從DNA水平反映各材料之間的遺傳差異，是研究生物遺傳多樣性的有力工具。AFLP標(biāo)記具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、可靠性高的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于

2、動(dòng)植物的遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、基因定位和標(biāo)記輔助選擇等方面。本研究采用AFLP標(biāo)記技術(shù)，首先對(duì)白肋型煙草葉色性狀基因進(jìn)行了標(biāo)記分析，在此基礎(chǔ)上對(duì)90份煙草種質(zhì)材料的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行了研究。主要結(jié)果如下： 1.通過(guò)SDS和CTAB兩種DNA提取方法的比較，認(rèn)為CTAB方法提取的煙草基因組DNA更適合于煙草AFLP分析的要求。 2.初步建立了煙草AFLP銀染分析體系。采用酶切連接一步法進(jìn)行煙草基因組DNA的酶切和

3、連接；預(yù)擴(kuò)增選用E+A和M+C引物；預(yù)擴(kuò)增結(jié)束后，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍，作為選擇性擴(kuò)增的模板；選擇性擴(kuò)增選用E+3和M+3引物；擴(kuò)增結(jié)束后，每個(gè)樣加入7μl的LoadingBuffer，95℃變性處理5min，變性后立即冷卻，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩＠?％的聚丙烯酰胺凝膠電泳，后用銀染法檢測(cè)。銀染程序?yàn)槟z版的固定脫色20min左右、水洗10min、銀染30min、快速漂洗不超過(guò)10s、顯帶6～7min、定影2～3min、水洗10min，

4、最后室溫干燥、統(tǒng)計(jì)記錄。 3.用白肋煙品種L8和正常綠色型烤煙品種大白筋599構(gòu)建了一個(gè)回交分離群體(BC1)，利用BSA法對(duì)白肋型煙草葉色性狀基因進(jìn)行AFLP標(biāo)記分析，找到一個(gè)與控制白肋型葉色性狀基因相連鎖的AFLP標(biāo)記E-CAA/M-GGCTY260。 4.利用AFLP熒光標(biāo)記技術(shù)，篩選出8對(duì)多態(tài)性較高的引物組合，分別是E-AAC/M-CAG,E-AAG/M-CAG,E-AAG/M-CTC,E-ACA/M-CAG,E

5、-ACA/M-CTA,E-ACA/M-CTC,E-ACA/M-CTT,E-ACT/M-CAG。利用8對(duì)引物對(duì)煙草7種類(lèi)型90份種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增分析，共擴(kuò)增出1358條帶，其中多態(tài)性條帶1346條，平均多態(tài)性條帶比率(PPB)為99.1％。 5.90份煙草種質(zhì)的Dice遺傳相似系數(shù)在0.33-0.89之間，平均為0.66，表明煙草種質(zhì)的遺傳相似程度較高，親緣關(guān)系較近。UPGMA聚類(lèi)顯示，在0.554的相似水平下，90份種質(zhì)可分為7類(lèi)：

6、第1類(lèi)包含了供試材料中的全部普通煙草種栽培種質(zhì)，共81份；2、3、4、5、6類(lèi)分別是由5個(gè)野生煙草種組成的單獨(dú)類(lèi)；第7類(lèi)由4份黃花煙草栽培種質(zhì)組成。在相似水平0.732處進(jìn)一步對(duì)栽培煙草種質(zhì)進(jìn)行劃分，81份普通煙草種質(zhì)又可分為8個(gè)亞類(lèi)；4份黃花煙草種質(zhì)可分為2個(gè)亞類(lèi)。聚類(lèi)結(jié)果表明，煙草不同種之間的遺傳差異較大，親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)；栽培種質(zhì)內(nèi)的遺傳差異相對(duì)較小，親緣關(guān)系較近；不同栽培類(lèi)型的品種大致聚在一起，種質(zhì)問(wèn)的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近并沒(méi)表現(xiàn)出和地

7、理來(lái)源的明確相關(guān)。 6.90份種質(zhì)的遺傳多樣性指數(shù)(h)為0.2451，Shannon信息指數(shù)(Ⅰ)為0.3780，表明煙草種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平相對(duì)較低。煙草不同類(lèi)型間的遺傳多樣性(Dst)為0.0801，類(lèi)型內(nèi)遺傳多樣性(Hs)為0.1233，遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.3921，基因流Nm為0.7753，表明煙草遺傳類(lèi)型內(nèi)分化大于類(lèi)型間分化；基因流指數(shù)(Nm)為中上等水平。 7.我國(guó)烤煙品種和美國(guó)烤煙品種間遺傳相