肺癌組織中EGFR19、21外顯子基因突變豐度的熒光偏振檢測研究.pdf

1、背景:
　　肺癌是全球男性死亡率最高的腫瘤，并且，在發(fā)達(dá)國家女性中，肺癌已超過乳腺癌，成為女性死亡的第一大腫瘤。人表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑類靶向治療藥物（EGFR-tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）是針對肺癌中EGFR及其信號通路的小分子阻斷劑，是一種化學(xué)合成的靶向治療藥物，在非小細(xì)胞肺癌特別是腺癌 EGFR敏感突變者中療效顯著，已被批準(zhǔn)單藥治療作為復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性晚期非小細(xì)胞型肺癌的二、

2、三線治療或一線治療。然而，近年來對EGFR-TKIs耐藥及療效差異性的報道屢見不鮮，此類藥物的敏感及耐藥相關(guān)因素也逐漸被發(fā)現(xiàn)，并用于篩選更加適合的患者。但是，在臨床中盡管一些患者含有EGFR敏感突變，卻也對EGFR-TKIs的療效較差。我們基于這一現(xiàn)象提出假設(shè)：腫瘤內(nèi)是否存在基因突變豐度的異質(zhì)性，并可能造成靶向治療的療效差異？
　　熒光偏振技術(shù)（fluorescence polarization，F(xiàn)P）是一種高靈敏度的熒光標(biāo)記檢測

3、方法，可檢測不同波長的熒光強(qiáng)度值，結(jié)合探針的靶向結(jié)合特性因而特別適用于基因突變的檢測。目前，大多數(shù)EGFR基因突變檢測技術(shù)未能檢測瘤內(nèi)基因突變豐度，因此不能全面評估瘤內(nèi)突變豐度的信息，為此我們基于熒光偏振技術(shù)在基因突變檢測方面的優(yōu)勢，初步設(shè)計并建立了一種檢測肺癌標(biāo)本中 EGFR基因敏感突變豐度的檢測方法以便為臨床預(yù)測靶向藥物的療效以及制定合理的治療策略提供依據(jù)。
　　目的:
　　建立一種快速、靈敏、特異的基于熒光偏振技術(shù)的檢

4、測體系和方法，并將該方法用于檢測肺癌標(biāo)本中EGFR19、21外顯子的基因突變豐度，以期全面準(zhǔn)確地預(yù)測靶向藥物個體化使用。另外，對接受吉非替尼治療的患者進(jìn)行隨訪，統(tǒng)計緩解率與生存期，進(jìn)一步證明EGFR基因突變豐度對吉非替尼藥物療效與預(yù)后的預(yù)測價值。
　　方法:
　　第一部分，建立熒光偏振檢測的標(biāo)準(zhǔn)體系。首先，提取含有EGFR19、21外顯子突變型與EGFR19、21外顯子野生型患者的全基因組DNA，設(shè)計引物，特異的熒光標(biāo)記探針

5、。然后，分別構(gòu)建EGFR19、21外顯子野生型與EGFR19、21外顯子突變型的4種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。最后，經(jīng)過熒光偏振PCR反應(yīng)，得出擴(kuò)增產(chǎn)物并使用熒光偏振儀檢測反應(yīng)液的偏振值（FP）。根據(jù)FP值與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的拷貝數(shù)繪制曲線圖，進(jìn)而根據(jù)曲線的線性趨勢得出直線方程。再經(jīng)過穩(wěn)定性，特異性，靈敏性的驗證后即作為后續(xù)實驗的定量標(biāo)準(zhǔn)。
　　第二部分，將建立好的標(biāo)準(zhǔn)體系和方法應(yīng)用于臨床肺癌病理標(biāo)本中EGFR19、21外顯子基因突變豐度的檢

6、測，并將患者的DNA經(jīng)普通PCR擴(kuò)增EGFR19、21外顯子目的序列后，送測序，將兩種檢測方法的結(jié)果進(jìn)行比較，驗證本法的準(zhǔn)確性。并對接受吉非替尼靶向治療的58例患者進(jìn)行療效和生存期的隨訪，運用統(tǒng)計學(xué)方法分析其與EGFR19、21外顯子基因突變豐度大小的關(guān)系，再次對該檢測方法的實用價值及有效性進(jìn)行驗證。
　　結(jié)果:
　　本研究所建立的標(biāo)準(zhǔn)體系經(jīng)過全面驗證，具有穩(wěn)定性好，靈敏性高，特異性強(qiáng)的優(yōu)點。該方法最低檢測濃度為40拷貝/u

7、l，最低可檢測的EGFR基因突變豐度大小為10％。該方法對標(biāo)本是否含有突變的檢測結(jié)果和直接測序法檢測結(jié)果相一致。將受試者的突變豐度與其接受吉非替尼的藥物療效以及生存期進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)基因突變豐度高者比低者對靶向藥物反應(yīng)性好，并且至疾病進(jìn)展時間（TTP）與總生存期（OS）具有差異性，并且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。
　　結(jié)論:
　　熒光偏振（FP）檢測技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合可用于基因突變及其突變豐度的檢測，并且有操