海洋來源化合物YCUA-6、YC-72、GC-29抗H5N1高致病流感病毒機(jī)理的研究.pdf

1、高致病性流感是一種急性傳染病，引起該疾病的為H5N1高致病性流感病毒。該病毒的天然宿主源于野生禽類，不表現(xiàn)出明顯癥狀，但卻可以導(dǎo)致大量家禽死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。自1997年中國(guó)香港首次證實(shí)了H5N1高致病流感病毒感染人類的病例，該病毒具備了跨越種屬障礙感染人類的能力，幸運(yùn)的是，尚不能造成人與人之間的傳播。目前的數(shù)據(jù)顯示，該病毒的傳播范圍在不斷擴(kuò)大，感染人數(shù)在不斷上升，未來大范圍的爆發(fā)高致病性流感的可能性越來越大。
　　 高致

2、病流感病毒目前尚無特效治療方法。疫苗被認(rèn)為是最有效的途徑，臨床上針對(duì)H5N1高致病人流感的疫苗正在研制過程中，但實(shí)際上疫苗的應(yīng)用具有滯后性和易變性等缺點(diǎn)，故尚未有理想的人用的高致病流感疫苗問世。藥物治療使用的神經(jīng)氨酸酶抑制劑和M2離子通道阻斷劑存在一定的副作用，并且臨床上已經(jīng)出現(xiàn)耐藥病毒株。因此，采用新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)尋找新穎的作用靶點(diǎn)成為研發(fā)抗病毒新藥的重點(diǎn)。
　　 流感病毒侵入細(xì)胞作為病毒感染宿主的第一步，同時(shí)也是研究抗流感病毒藥

3、物的重要環(huán)節(jié)。血凝素蛋白（HA）在流感病毒侵入宿主細(xì)胞過程中起關(guān)鍵作用：成熟的HA由HA1和HA2兩個(gè)亞基組成，其功能分別為識(shí)別并結(jié)合宿主細(xì)胞表面受體唾液酸（SA）及介導(dǎo)膜融合過程。作為一個(gè)新靶點(diǎn)，目前尚未有以HA為靶點(diǎn)的藥物，所以建立以HA為靶點(diǎn)的藥理篩選模型對(duì)尋找抗}t5N1高致病流感病毒藥物具有重要意義。
　　 目的：
　　 建立由流感病毒外殼蛋白（HA）與人類免疫缺陷病毒HIV-1核心包裝成的重組病毒藥理篩選模型

4、，尋找作用于HA的抗H5N1高致病流感病毒的化合物并對(duì)其進(jìn)行機(jī)制研究。
　　 方法：
　　 （1）應(yīng)用Western blot和HA抗體結(jié)合實(shí)驗(yàn)對(duì)HA蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行考查；
　　 （2）應(yīng)用流感病毒外殼蛋白質(zhì)粒HA與艾滋病毒核心基因組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，制備重組病毒HA（Viet）/HIV-luc，HA（QH）/HIV-luc，HA（H5N2）/HIV-Iuc；
　　 （3）應(yīng)用重組病毒對(duì)不同細(xì)胞系感染實(shí)驗(yàn)對(duì)重

5、組病毒的感染能力進(jìn)行考察；
　　 （4）對(duì)不同病毒株進(jìn)行稀釋（1：2，1：4，1：8，1：16，1：32），繪制滴度-相關(guān)熒光素酶活性單位曲線，考察該模型進(jìn)行定量分析的可行性；
　　 （5）應(yīng)用HA（Viet）/HIV-luc模型對(duì)2000余種化合物進(jìn)行初篩，進(jìn)一步地采用重組病毒HA（Viet）/MLV-GFP、VSVG/HIV-luc、VSVG/MLV-GFP和不同的細(xì)胞系對(duì)活性化合物的作用靶點(diǎn)進(jìn)行確定；
　　

6、 （6）應(yīng)用MTT法檢測(cè)活性化合物對(duì)宿主細(xì)胞的毒性；
　　 （7）將化合物與宿主細(xì)胞孵育不同時(shí)間，通過比較考察化合物對(duì)宿主細(xì)胞表面受體表達(dá)的影響；
　　 （8）應(yīng)用HA介導(dǎo)的細(xì)胞細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步考察藥物的作用環(huán)節(jié)。
　　 結(jié)果：
　　 （1）對(duì)重組病毒模型HA（Viet）的表達(dá)采用了分子生物學(xué)的方法進(jìn)行考察：Western blot結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后提取宿主細(xì)胞蛋白，檢測(cè)到HA蛋白的表達(dá)，并且清

7、楚看到HA0和HA1條帶；
　　 （2）通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染法制備出外殼蛋白為血凝素HA（不同來源），核心為HIV（報(bào)告基因?yàn)?luc）的重組病毒，即HA（Viet）/HIV-luc、HA（QH）/HIV-kuc、HA（H5N2）/HIV-luc。病毒原液加入后感染293ET細(xì)胞，HA（Viet）/HIV-luc相關(guān)熒光素酶活性單位（RLUs）達(dá)到2×107，接近FB15熒光檢測(cè)器的最大檢測(cè)值；HA（QH）/HIV-luc和HA（H5

8、N2）/HIV-luc原液感染293ET細(xì)胞，其RLUs分別達(dá)到106和105，比陰性對(duì)照組相的信號(hào)高3-5個(gè)數(shù)量級(jí)，表明模型已經(jīng)初步建立；
　　 （3）隨后進(jìn)行了重組病毒顆粒對(duì)人類不同組織來源的細(xì)胞系進(jìn)行感染性檢測(cè)，結(jié)果表明重組病毒顆粒可以感染多種細(xì)胞，尤其對(duì)293ET和A549細(xì)胞的感染性較強(qiáng)?？贵w結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)合結(jié)果顯示抗HA的多克隆抗體可以阻斷病毒對(duì)宿主細(xì)胞293ET和A549的感染。以上的實(shí)驗(yàn)證實(shí)重組病毒HA（Viet）/

9、HIV-luc具有高度感染能力。病毒滴度-相關(guān)熒光素酶活性單位曲線可以清楚的反映出重組病毒核心復(fù)制水平與熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)水平間的劑量依賴效應(yīng)。因此，該模型可用于針對(duì)HA侵入宿主細(xì)胞和HIV-1復(fù)制環(huán)節(jié)的雙靶點(diǎn)藥物篩選模型：
　　 （4）篩選2000余種樣品得到3個(gè)海洋來源的活性化合物YCUA-6，YC-72，GC-29，經(jīng)過HA（Viet）/HIV、HA（Viet）/MLV-GFP、VSVG/HIV-luc、VSVG/MLV

10、-GFP四組模型進(jìn)行特異性比較，結(jié)果表明三個(gè)化合物在10μM濃度下對(duì)HA（Viet）/HIV-luc和HA（Viet）/MLV-GFP的抑制率>50％，而在相同濃度下對(duì)VSVG/HIV-luc對(duì)照組模型的抑制率<20％，對(duì)VSVG/MLV-GFP對(duì)照組無抑制作用。因此，YCUA-6，YC-72，GC-29三個(gè)海洋來源的化合物具有抗H5N1高致病流感的藥理活性?；钚曰衔镌?0μM濃度下可以阻斷HA（Viet）/HIV-luc感染宿主29

11、3ET和A549細(xì)胞，抑制率均大于50％且無顯著性差異；
　　 （5）MTT結(jié)果顯示，10μM濃度下，活性化合物對(duì)293ET和A549細(xì)胞作用48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)之后均無細(xì)胞毒作用；
　　 （6）活性化合物誘導(dǎo)宿主細(xì)胞15分鐘和24小時(shí)后，進(jìn)行感染性檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染的程度無顯著性差異；
　　 （7）活性化合物對(duì)三株重組病毒HA（Viet）/HIV-luc，HA（QH）/HIV-luc，HA（H5N2）/

12、HIV-luc均有抑制作用，而且IC50值均在1-10μM：
　　 （8）HA介導(dǎo)的細(xì)胞.細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與DMSO對(duì)照組比較，活性化合物都能夠抑制HA蛋白與宿主之間的相互作用，其中以YCUA-6的作用最為明顯。
　　 結(jié)論：
　　 （1）成功建立了3種流感病毒血凝素蛋白HA介導(dǎo)的重組病毒模型，成功優(yōu)化了以流感病毒侵入環(huán)節(jié)為靶點(diǎn)的細(xì)胞水平的藥理學(xué)篩選模型；
　　 （2）通過篩選不同來源的2000余個(gè)