昆明山海棠總生物堿抗腫瘤活性及其主要成分分離分析的初步研究.pdf

1、目的：
　　 昆明山海棠[Tripterygium Hypoglaucum(Levl.)Hutch,THH]為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物,祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥取其全根、去皮根、根皮及莖枝等入藥。研究顯示THH總生物堿(THHta)具有明顯的體外抗腫瘤活性,能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡,深入研究THHta的抗腫瘤活性及其物質(zhì)基礎(chǔ)對(duì)THHta的開(kāi)發(fā)研究十分必要。以THH去皮根中試提取制備THHta,研究其體外、體內(nèi)抗腫瘤活性。確證THHta抗腫

2、瘤活性后研究其抗腫瘤活性的機(jī)制及其主要成分,為基于THHta的抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及開(kāi)發(fā)方向參考。
　　 方法
　　 (1)THHta提取:基于文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室提取方法,與遼寧本溪國(guó)家中成藥工程技術(shù)研究中心合作進(jìn)行中試規(guī)模提取。按照藥典中THH總生物堿的鑒定反應(yīng)進(jìn)行定性。
　　 (2)THHta的抗腫瘤活性:選用敏感的腫瘤細(xì)胞株HL60、MOLT-4、HCT116及PC3,利用MTT、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)研究TH

3、Hta的體外抗腫瘤活性。利用HCT116裸鼠移植瘤模型評(píng)價(jià)THHta的體內(nèi)抗結(jié)腸癌活性。
　　 (3)THHta致突變作用:利用Ames試驗(yàn)檢測(cè)THHta的致突變作用。
　　 (4)THHta抗腫瘤作用機(jī)制研究:利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)THHta對(duì)HCT116細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響。利用western blot及免疫組化檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)的部分蛋白表達(dá)情況,探討THHta抗腫瘤活性的作用機(jī)制。
　　 (5)THH

4、ta活性部位主要成分的分離分析及結(jié)構(gòu)鑒定:結(jié)合薄層層析(TLC)檢測(cè),運(yùn)用硅膠吸附層析、制備高效液相色譜(HPLC)技術(shù),對(duì)THHta活性部位進(jìn)行分離、純化得到化合物單體。結(jié)合理化常數(shù)的測(cè)定,利用IR、1HNMR、13CNMR等技術(shù)結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)單體化合物進(jìn)行鑒定。
　　 結(jié)果
　　 (1)中試提取THHta得率為0.76‰,初步鑒定為生物堿。
　　 (2)中試提取的THHta抑制HL60、MOLT-4、HCT1

5、16及PC3細(xì)胞的增殖,呈明顯的量效、時(shí)效依賴關(guān)系。中試THHta作用MOLT-4、HL60、HCT116及PC3細(xì)胞48h對(duì)應(yīng)的IC50值為1.62±0.12、9.01±1.10、19.11±6.34、50.91±11.41 ug/ml,作用HCT116、PC3細(xì)胞72h對(duì)應(yīng)的IC50值為3.59±0.86、21.62±1.88 ug/ml。實(shí)驗(yàn)室提取THHta作用MOLT-4、HL60、HCT116及PC3細(xì)胞48h對(duì)應(yīng)的IC50值

6、為1.95±0.45、9.33±0.24、21.93±5.36、40.14±1.20μg/ml,作用HCT116、PC3細(xì)胞72h對(duì)應(yīng)的IC50值為3.50±0.61、18.55±1.38μg/ml。中試提取的THHta能誘導(dǎo)MOLT-4、HL60細(xì)胞周期阻滯于G0/G1,能誘導(dǎo)MOLT-4細(xì)胞凋亡。
　　 (3)THHta各劑量組(27、135、675ug/皿)對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA97、TA98、TA100和TA102誘發(fā)的回

7、變菌落數(shù),在±S9條件下,均未超過(guò)對(duì)照組2倍。THHta對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA97、TA98、TA100和TA102無(wú)直接和間接致突變作用。
　　 (4)THHta能顯著抑制TPA誘導(dǎo)的JB6 C141轉(zhuǎn)化細(xì)胞集落形成(P＜0.01),呈量效依賴關(guān)系。1.25、2.5、5.0和10μg/ml THHta對(duì)TPA誘導(dǎo)的JB6 C141轉(zhuǎn)化細(xì)胞集落形成抑制率為:54.4％、84.7％、97.8％和99.8％。
　　 (5)TH

8、Hta顯著抑制HCT116細(xì)胞的錨著非依賴性生長(zhǎng)(P＜0.01),呈量效依賴關(guān)系。0.625、1.25、2.5、5.0和10μg/ml THHta對(duì)HCT116細(xì)胞集落形成的抑制率為:53.5％、74.0％、89.5％、92.2％和94.6％;IC50值為0.44μg/ml。
　　 (6)THHta能夠抑制HCT116裸鼠移植瘤生長(zhǎng)。治療組HCT116裸鼠移植瘤的平均體積與對(duì)照組相比,在給藥第6天后,200 mg/kg THHt

9、a組瘤體積顯著小于對(duì)照組,出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);在給藥第9天至實(shí)驗(yàn)結(jié)束100、200mg/kg THHta治療組平均瘤體積均顯著小于對(duì)照組(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),對(duì)照組、100mg/kg THHta、200mg/kgTHHta組HCT116裸鼠移植瘤的平均體積分別是給藥時(shí)瘤體積的9.39倍,1.93倍和0.83倍。THHta100mg/kg組在給藥后第9、12、15、18、21、24天的相對(duì)腫瘤增殖率(T/C％)分別為4

10、9.5％、31.4％、31.8％、21-3％、18.5％、20.5％1200mg/kg THHta組在給藥后第6、9、12、15、18、21、24天的T/C值分別為45.4％、31.7％、26.6％、17.9％、15.4％、11.9％、8.9％。由100mg/kg、200mg/kg THHta組的T/C值可知,THHta抑制HCT116裸鼠移植瘤的增殖,且與時(shí)間和劑量呈依賴關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)100mg/kg、200mg/kg THHta組

11、的平均瘤重為0.72±0.27g和0.36±0.17g,與對(duì)照組1.82±0.49g比較,治療組移植瘤平均重量均顯著輕于對(duì)照組(P＜0.01)。THHta100mg/kg、200mg/kg對(duì)HCT116裸鼠移植瘤的瘤重抑制率分別為60.4％和80.2％。
　　 (7)THHta治療組與對(duì)照組荷瘤裸鼠的平均體重變化趨勢(shì)一致,隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng),裸鼠體重減輕。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),荷瘤裸鼠體重與實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)相比,對(duì)照組降低了16.8％,THHta1

12、00 mg/kg治療組降低了13.9％,而200 mg/kg組降低了24.2％。THHta治療組的荷瘤裸鼠心、肝、脾和腎臟的臟器系數(shù)與對(duì)照組之間比較均無(wú)明顯差異(P＞0.05)且數(shù)值十分接近。各組荷瘤裸鼠心、肝、脾和腎的HE染色組織切片光學(xué)顯微鏡下觀察均無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移及器質(zhì)性改變。
　　 (8)THHta對(duì)HCT116細(xì)胞周期及凋亡均有影響。0、10、20、40μg/ml THHta作用經(jīng)血清饑餓法同步化的HCT116細(xì)胞24h,H

13、CT116細(xì)胞中G0/G1期比例為73.6％、81.4％、85.6％、83.0％,顯示THHta能導(dǎo)致HCT116細(xì)胞中G0/G1期比例增加。10μg/mlTHHta作用HCT116細(xì)胞12、24h、36h亦能引起HCT116細(xì)胞中G0/G1期比例增加。THHta能誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡,10μg/ml THHta作用HCT116細(xì)胞12h、24h和36h誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞比例增加與時(shí)間呈依賴關(guān)系,36h凋亡細(xì)胞比例為20.4％。

14、　　 (9)Western blot結(jié)果顯示,THHta能改變HCT116細(xì)胞G1/S期調(diào)控蛋白表達(dá)。THHta(1.25-10μg/ml)作用HCT116細(xì)胞12h、24h、36h、48h,c-Myc蛋白的表達(dá)逐漸減弱,且與時(shí)間和劑量呈依賴關(guān)系。1.25-5.0μg/ml THHta作用HCT16細(xì)胞36h能使P21蛋白表達(dá)增強(qiáng)。與對(duì)照組比較,10μg/ml THHta引起HCT116細(xì)胞Cyclin D1蛋白的表達(dá)減弱;CDK4蛋

15、白表達(dá)在36h時(shí)相點(diǎn),隨THHta濃度增加表達(dá)減弱;CDK6蛋白表達(dá)在36h、48h時(shí)相點(diǎn),隨THHta濃度增加表達(dá)減弱。
　　 (10)Western blot結(jié)果顯示,THHta能改變HCT116細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。10μg/ml THHta處理HCT116細(xì)胞12h、24h、36h、48h,與對(duì)照組比較活化的PARP蛋白、活化的Caspase3蛋白、活化的Caspase8蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng),且與時(shí)間和劑量呈一定依賴關(guān)系。2

16、.5-10μg/ml THHta作用HCT116細(xì)胞36h、48h能減弱抑凋亡蛋白Bcl2、Bcl-xl、XIAP的表達(dá)。
　　 (11)免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示,THHta體內(nèi)能夠抑制HCT116移植瘤細(xì)胞PCNA、突變P53蛋白的表達(dá),而對(duì)P21、P27蛋白表達(dá)有增強(qiáng)作用。
　　 (12)THHta活性部位中初步分離分析并鑒定出以下9個(gè)單體化合物:木栓酮醛、齊墩果酸乙酸酯、雷公藤內(nèi)酯乙、雷公藤內(nèi)酯甲、雷公藤次堿、雷公藤定

17、堿、雷公藤吉堿、β-谷甾醇和胡蘿卜苷。
　　 結(jié)論
　　 中試提取THHta方法可行,得率較實(shí)驗(yàn)室提取方法高。中試提取的THHta(ZS-THHta)體外具有明顯的抑制MOLT-4、HL60、HCT116和PC3細(xì)胞增殖活性,且與時(shí)間和劑量呈依賴關(guān)系,與實(shí)驗(yàn)室提取THHta的體外抗腫瘤活性無(wú)明顯差異。ZS-THHta能夠誘導(dǎo)MOLT-4、HCT116細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期及細(xì)胞凋亡。ZS-THHta能夠抑制HCT11