IL-1β和TNF-α對大鼠平滑肌細胞內(nèi)皮脂肪酶表達水平的影響及阿托伐他汀的干預作用.pdf

1、一、IL-1β及TNF-α對大鼠主動脈平滑肌細胞(RASMC)內(nèi)皮脂肪酶表達水平的影響 目的：觀察IL-1β及TNF-α對RASMC EL表達的影響。 方法：采用貼塊法原代培養(yǎng)RASMC，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，通過α-肌動蛋白免疫熒光法對培養(yǎng)細胞進行鑒定。選用第3-5代細胞進行實驗，研究對象隨機分為三組：(1)空白對照組(不加干預措施原培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng))；(2)IL-1β干預組：①不同濃度IL-1β干預組：分別

2、以終濃度為1、5、10、20、30ng/mL的IL-1β與RASMC作用24小時；②不同時間IL-1β干預組：終濃度為30ng/mL的IL-1β與RASMC分別作用1、6、12、18、24、48、72小時；(3)TNF-α干預組：①不同濃度TNF-α干預組：分別以終濃度為5、10、15、20、50ng/mL與RASMC作用24小時；②不同時間TNF-α干預組：終濃度為50ng/mL的TNF-α與RASMC分別作用1、6、12、18、24

3、、48、72小時。用ELISA與RT-PCR方法分別檢測RASMC的EL蛋白及mRNA表達水平。 結(jié)果： 1.細胞鑒定：熒光顯微鏡下可見細胞胞漿內(nèi)均呈現(xiàn)綠色熒光，即胞漿內(nèi)表達α-肌動蛋白，符合平滑肌細胞特征。 2.上清液LDH活性檢測結(jié)果顯示，IL-1β 50ng/mL組(102.31±2.35)和TNF-α 100ng/mL組(134.56±β1.78)顯著高于空白對照組(70.17±2.13)(P<0.05)

4、，其余實驗組與空白對照組的LDH活性無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。說明50ng/mL IL-1β和100ng/mL TNF-α對細胞有毒性作用。在接下來的實驗中排除這兩個濃度值。 3.IL-1β及TNF-α對RASMC EL蛋白表達水平的影響(1)不同濃度IL-1β及TNF-α對RASMC EL蛋白表達水平的影響： (2)IL-1β及TNF-α對RASMC作用不同時間后EL蛋白表達水平的影響： ①RASMC經(jīng)終濃度

5、為30ng/mL IL-1β誘導不同時間后，EL蛋白表達水平分別為37.46±1.40、47.17±1.11、57.12±1.70、88.74±1.74、114.77±1.17、119.69±1.35、125.18±1.13ng/mL，各時間組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。EL蛋白表達水平隨時間延長呈上升趨勢(分別較前一個時間點增加了25.92％、21.09％、21.20％、55.36％、29.33％、4.29％、4.59％)

6、。發(fā)現(xiàn)在12～24h之間EL蛋白表達水平升高顯著，之后緩慢上升，至72h達最高濃度值。 ②RASMC經(jīng)終濃度為50ng/mL TNF-α誘導不同時間后，EL蛋白表達水平分別為37.46±1.40、47.17±1.11、53.97±1.08、80.90±1.06、104.31±2.33、116.34±0.84、125.51±1.73ng/mL，各時間組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。EL蛋白表達水平隨時間延長呈上升趨勢(分

7、別較前一個時間點增加了25.92％、21.09％、21.20％、55.36％、29.33％、4.29％、4.59％)。發(fā)現(xiàn)在12～24h之間EL蛋白表達水平升高顯著，之后緩慢上升，至72h達最高濃度值。 4.IL-1β及TNF-α對RASMC ELmRNA水平的影響(1)不同濃度IL-1β及TNF-α對RASMC ELmRNA水平的影響： ①RASMC經(jīng)不同濃度IL-1β誘導24h后，RASMC ELmRNA表達呈劑量依

8、賴性上調(diào)，分別為：0.458±0.018、0.681±0.015、0.787±0.019、0.856±0.023、0.936±0.017，與對照組0.387±0.02比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；各濃度組間比較差異亦有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 ②RASMC經(jīng)不同濃度TNF-α誘導24h后，RASMC ELmRNA表達呈劑量依賴性上調(diào)，分別為：0.498±0.028、0.591±0.035、0.697±0.039、0.

9、812±0.021、0.915±0.021，與對照組0.387±0.02比較差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.05)；各濃度組間比較差異亦有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 (2)IL-1β及TNF-α對RASMC作用不同時間后ELmRNA水平的影響： ①RASMC經(jīng)終濃度為30ng/mL L-1β誘導不同時間后，ELmRNA表達隨時間延長上調(diào)，分別為0.458±0.028、0.512±0.024、0.581±0.017、0.772

10、±0.031、0.936±0.017、0.962±0.010、0.976±0.017，各時間組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 ②RASMC經(jīng)終50ng/mL TNF-α誘導不同時間后，ELmRNA表達隨時間延長上調(diào)，分別為0.478±0.013、0.535±0.016、0.597±0.018、0.765±0.011、0.915±0.021、0.953±0.015、0.985±0.022，各時間組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜

11、0.05)。 結(jié)論：IL-1β、TNF-α均能誘導RASMC EL表達，并且呈時間一劑量依賴性。 二、阿托伐他汀(AT)對IL-1β和TNF-α誘導的RAsMC EL表達的影響 目的：觀察AT對炎癥因子誘導的RASMC EL表達的影響，進一步探討他汀類藥物的調(diào)脂外作用。 方法：仍以原代培養(yǎng)的RASMC為研究對象，培養(yǎng)至第3代后分組實驗。研究對象分為①對照組：(不加干預措施原培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng))；②IL-1β(

12、TNF-α)組：加入終濃度為30ng/mL IL-1β或50ng/mL TNF-α與RASMC作用24小時：③AT組：加入AT 10-5mmol/L與RASMC作用24小時；④IL-1β(TNF-α)+AT組：加AT前1小時，先加入終濃度為30ng/mL IL-1β或50ng/mL TNF-α，再加入AT使其終濃度分別為10-7 mmol/L、10-6mmol/L、10-5mmol/L，繼續(xù)與RASMC培養(yǎng)24小時。用ELISA與RT-

13、PCR方法分別檢測EL蛋白及mRNA表達水平結(jié)果： 1.MTT結(jié)果： 外源性加入不同濃度的阿托伐他汀后，分別作用3、6、12、24、48h，同對照組相比，細胞增殖能力無明顯變化(P>0.05)。說明干預藥物本身對細胞沒有毒性作用。 2.阿托伐他汀對IL-1β誘導RASMC EL蛋白及mRNA表達的影響： (1)ELISA結(jié)果分析顯示：隨阿托伐他汀給藥濃度的增加(10-7、10-6、10-5mmol/L)，

14、IL-1β誘導RASMC EL蛋白表達水平呈下降趨勢，其濃度值分別為88.21±1.46、74.13±1.79、69.17±2.36 ng/mL，與對照組(34.17±1.73 ng/mL)、IL-1β組(114.77±1.17 ng/mL)、AT組(24.21±2.45 ng/mL)比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，各藥物干預組之間比較差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 (2)RT-PCR結(jié)果分析顯示：隨阿托伐他汀給藥

15、濃度的增加(10-7、10-6、10-5mmol/L)，IL-1β誘導RASMC ELmRNA表達下調(diào)，其相對值分別為0.561±0.163、0.503±0.024、0.396±0.126，與對照組(0.387±0.02)、IL-1β組(0.936±0.017)、AT組(0.301±0.202)比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，各藥物干預組之間比較差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 3.阿托伐他汀對TNF-α誘導RASM

16、C EL蛋白及mRNA表達的影響： (1)ELISA結(jié)果分析顯示：隨阿托伐他汀給藥濃度的增加(10-7、10-6、10-5 mmol/L)，TNF-α誘導RASMC EL蛋白表達水平呈下降趨勢，其濃度值分別為80.32±1.07、69.21±1.39、61.15±2.64 ng/mL，與對照組(34.17±1.73 ng/mL)、TNF-α組(104.31±2.33 ng/mL)、AT組(24.21±2.45 ng/mL)比較差

17、異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，各藥物干預組之間比較差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 (2)RT-PCR結(jié)果分析顯示：隨阿托伐他汀給藥濃度的增加(10-7、10-6、10-5mmol/L)，TNF-α誘導RASMC ELmRNA表達下調(diào)，其相對值分別為0.549±0.143、0.491±0.154、0.423±0.103，與對照組(0.387±0.02)、TNF-α組(0.915±0.021)、AT組(0.301±0.20