基于差示掃描量熱法和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)尋找腦脊液中膠質(zhì)瘤惡性程度相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物.pdf

1、目的:在成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)各種原發(fā)性腫瘤中，以膠質(zhì)瘤(glioma)最常見是，約占60％，其中惡性程度最高的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma，GBM)又占全部膠質(zhì)瘤的一半以上。GBM生物學(xué)上呈現(xiàn)侵襲性生長，手術(shù)無法全切。即便予以最大安全程度切除，輔助以放、化療，腫瘤從原發(fā)灶復(fù)發(fā)幾乎無法避免，患者復(fù)發(fā)率和死亡率仍很高。膠質(zhì)瘤惡性程度特異性生物學(xué)標(biāo)志物，被認(rèn)為有望協(xié)助神經(jīng)腫瘤醫(yī)生早

2、期、有效地診斷膠質(zhì)瘤，監(jiān)測治療反應(yīng)，預(yù)警復(fù)發(fā)，甚至用于開發(fā)膠質(zhì)瘤患者的個體化治療方案，因此是目前神經(jīng)外科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。而腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)因為其特殊的生理位置與生物學(xué)功能，一直是尋找中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物的重要樣本來源。本課題的目的是通過比較不同惡性程度膠質(zhì)瘤患者來源的CSF蛋白質(zhì)組的改變，從宏觀的物理學(xué)熱穩(wěn)定特征，到微觀上的高豐度和低豐度蛋白質(zhì)組成分，嘗試尋找與膠質(zhì)瘤惡性程度相關(guān)的

3、生物學(xué)標(biāo)志物，為后續(xù)臨床研究和轉(zhuǎn)化奠定一定的實驗室基礎(chǔ)。
　　方法:在第一部分，我們選用了39例患者來源的樣本，包括36個CSF樣本和3個GBM腫瘤囊腫液樣本，對其進(jìn)行超濾濃縮、換鹽、蛋白定量等預(yù)處理后，采用現(xiàn)代高靈敏度的差示掃描量熱儀，分析膠質(zhì)瘤CSF的蛋白質(zhì)組在不同疾病狀態(tài)下整體熱穩(wěn)定性的改變，并通過ELISA的方法對CSF蛋白質(zhì)組的高豐度組分進(jìn)行定量，初步探討熱穩(wěn)定性改變的可能機(jī)制;DSC的優(yōu)點(diǎn)是快速簡便，對樣本預(yù)處理要求低

4、，但是其描述的熱力學(xué)參數(shù)僅是蛋白質(zhì)組宏觀上整體的物理特征，尚缺乏微觀上，尤其是對疾病狀態(tài)下低豐度蛋白質(zhì)成分改變的直接檢測能力，而以質(zhì)譜技術(shù)為代表的蛋白質(zhì)組技術(shù)平臺，能很好地彌補(bǔ)這個不足。因此在第二部分，我們首先從Pubmed檢索現(xiàn)有的基于膠質(zhì)瘤CSF開展的蛋白質(zhì)組研究工作，對它們進(jìn)行系統(tǒng)綜述，對不同研究采用的研究方案進(jìn)行總結(jié)與比較，并歸納各項研究發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)蛋白（潛在生物學(xué)標(biāo)志物）。在此基礎(chǔ)上，通過應(yīng)用PANTHER分類系統(tǒng)及IPA軟

5、件等在線生物信息學(xué)方法，探尋不同研究發(fā)現(xiàn)之間是否存在一定的內(nèi)在聯(lián)系，并基于IPA網(wǎng)絡(luò)尋找新的潛在膠質(zhì)瘤CSF標(biāo)志物，最后用ELISA的方法在我們自己收集的29例患者來源的樣本中進(jìn)行驗證;在第二部分文獻(xiàn)復(fù)習(xí)的基礎(chǔ)上，我們在第三部分研究中選用了44例患者來源的樣本，首先用ProteoMiner試劑盒去除其中的高豐度蛋白并富集低豐度蛋白，然后樣本通過過柱去鹽，Bradford法蛋白定量，酶切肽段等處理后，應(yīng)用iTRAQ標(biāo)記結(jié)合二維納升級反向液

6、相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，鑒定并相對定量分析樣本中的蛋白成分，并依據(jù)不同篩選條件得到差異表達(dá)蛋白。對這些差異表達(dá)蛋白，首先結(jié)合生物信息學(xué)分析及文獻(xiàn)檢索的方法，初篩獲得目前尚未在膠質(zhì)瘤研究中報道的新的蛋白分子，然后用ELISA的方法在膠質(zhì)瘤患者CSF中驗證其組間差異表達(dá)的存在，最后在新收集的6例CSF中驗證用這些差異蛋白去鑒別膠質(zhì)瘤惡性程度的可靠性。除此之外，我們還收集了5例GBM組織的原代細(xì)胞上清和9種惡性腫瘤細(xì)胞系上清，后者包括4種

7、人GBM細(xì)胞系，2種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和3種非膠質(zhì)瘤腫瘤細(xì)胞系，用ELISA的方法對鑒定到的新蛋白進(jìn)行檢測，探討這些差異蛋白可能的來源。
　　結(jié)果:在第一部分，我們發(fā)現(xiàn)非腫瘤對照組CSF的DSC曲線，其主要轉(zhuǎn)變溫度或熔解溫度(melting temperature，Tm)是在73.2℃，與之相比，良性腦腫瘤組與低級別膠質(zhì)瘤組的Tm值分別升高到了73.8℃和74.1℃，而GBM組的Tm值升高最為明顯(75.6℃)，統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)GBM組與

8、其它組之間的差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。進(jìn)一步檢測樣本總蛋白濃度后發(fā)現(xiàn)，來自GBM患者的CF樣本顯著高于其它CSF組(P＜0.001)，而GBM CSF組也顯著高于其它CSF組(P＜0.05或P＜0.01)。在10種被檢測的高豐度蛋白中，5種蛋白分別占CSF和CF中被檢測蛋白總含量的99％和98％以上。除了AGP外，GBM患者CF中9種蛋白的含量顯著性高于各組CSF(P＜0.05或P＜0.001)。而GBM CSF中ALB，I

9、gG，AAT，F(xiàn)IB，APOA1和TRF等6種蛋白的濃度顯著性高于其它CSF組。比較這些蛋白的相對含量后發(fā)現(xiàn)，CF中AAT，F(xiàn)IB，Cys-C和C3的相對含量較高，而在不同的CSF組間，GBM組CSF中IgG，AAT和TRF的相對含量較高，上述高豐度蛋白絕度和相對含量的改變，可能是蛋白質(zhì)組總體Tm值變化的原因之一;在第二部分，根據(jù)預(yù)設(shè)的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，一共檢索到了8篇文獻(xiàn)，共計有19種蛋白被上述文獻(xiàn)驗證為存在于膠質(zhì)瘤患者來源CSF中的差

10、異表達(dá)蛋白。根據(jù)GO注釋與PANTHER分析，絕大部分這些差異表達(dá)蛋白的分子功能是“結(jié)合”，亞細(xì)胞定位為“細(xì)胞外區(qū)域”;值得注意的是，它們參與的生物學(xué)過程為“炎癥反應(yīng)”，“應(yīng)激/缺氧應(yīng)答”和“凋亡過程”等，提示它們可能參與了膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展和宿主抗腫瘤免疫應(yīng)答等過程。根據(jù)HPA數(shù)據(jù)庫，絕大部分這些蛋白在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)量與正常CNS組織相比是升高的。在這19種蛋白中，只有一種蛋白被不同的文獻(xiàn)重復(fù)鑒定到，而這可能是由于不同研究在具體采用的

11、實驗方案上存在差異所造成。IPA分析顯示，這19種蛋白具有包括“炎癥反應(yīng)”、“癌癥”、“細(xì)胞死亡和生存”在內(nèi)的重要功能，參與了包括“急性期反應(yīng)信號通路”、“VEGF信號通路”，“p38信號通路”等重要的通路，構(gòu)建的第一個網(wǎng)絡(luò)圖的核心蛋白分子主要位于細(xì)胞核內(nèi)，具有DNA結(jié)合，催化活性和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性等生物學(xué)功能，而第二個網(wǎng)絡(luò)圖顯示IL-6/STAT-3信號通路處于核心地位。據(jù)此，我們挑選了GAL，HSPA5，WNT和IL-6等4個節(jié)點(diǎn)蛋白，

12、在本課題收集的CSF與CF中進(jìn)行了驗證，結(jié)果表明，GAL，HSPA5與WNT三個蛋白的含量在CF中顯著性低于CSF，但是在不同CSF組間不存在統(tǒng)計學(xué)差異;而IL-6不僅在GBM CF中的濃度顯著高于其他CSF組(P＜0.001)，而且在GBM CSF中的濃度顯著性高于其他惡性度較低膠質(zhì)瘤組的CSF(P＜0.001)，提示IL-6具有成為GBM生物學(xué)標(biāo)志物的潛力;在第三部分，我們在經(jīng)過低豐度蛋白富集后的CSF中總共鑒定得到445種蛋白成分

13、。根據(jù)GO注釋，它們的細(xì)胞定位主要集中于細(xì)胞外(24％)、細(xì)胞膜(13％)、細(xì)胞質(zhì)(11％)、其它細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器(11％)等，參與的生物學(xué)過程主要是調(diào)節(jié)(22％)、細(xì)胞過程(18％)、代謝過程(9％)、對刺激反應(yīng)(9％)等，具有的分子功能主要是結(jié)合(48％)、催化活性(22％)、蛋白酶調(diào)節(jié)活性(10％)等。在這445種蛋白中，144種蛋白的表達(dá)與星形細(xì)胞瘤惡性程度相關(guān)，14種蛋白與膠質(zhì)瘤瘤惡性程度相關(guān)，17種蛋白在高級別膠質(zhì)瘤(HGG)

14、和LGG組間有顯著性差異表達(dá)，179種蛋白在原發(fā)和復(fù)發(fā)GBM組間有差異，135種蛋白在高級別少突膠質(zhì)瘤和低級別少突膠質(zhì)瘤之間有差異。IPA分析顯示，由這些差異蛋白構(gòu)建的分子信號網(wǎng)絡(luò)中，涉及的Top Functions主要有蛋白合成，脂質(zhì)代謝和小分子生化，碳水化合物代謝，細(xì)胞間信號傳導(dǎo)，免疫細(xì)胞遷移，體液性免疫應(yīng)答，炎癥反應(yīng)，DNA復(fù)制、重組和修復(fù)，癌癥，細(xì)胞運(yùn)動，分子轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞死亡和生存，細(xì)胞周期等。通過ELISA驗證后，6種蛋白的含量

15、被證實在GBM組CSF中的含量顯著性高于其它惡性較低膠質(zhì)瘤CSF組，它們分別是vinculin(VCL)蛋白、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A4、靜止素Q6巰基氧化酶1、肌肽二肽酶、血小板因子4和分泌型卷曲相關(guān)蛋白3。比較上述蛋白在GBM組織原代細(xì)胞培養(yǎng)上清和CSF中的含量后發(fā)現(xiàn)，SFRP3和VCL，尤其是后者在細(xì)胞上清中的含量顯著高于CSF，提示它們可能來源于腫瘤分泌。比較膠質(zhì)瘤細(xì)胞系與非膠質(zhì)瘤細(xì)胞系培養(yǎng)上清后發(fā)現(xiàn)，QSOX1、SFRP3和VCL

16、在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系上清中的含量較高，提示它們的分泌可能具有膠質(zhì)瘤特異性，尤其是QSOX1，其濃度在H4、SW1783和U87這三種惡性度逐級上升的細(xì)胞系上清中也呈現(xiàn)逐級升高的趨勢，提示可能與膠質(zhì)瘤惡性程度具有較好的相關(guān)性。上述蛋白在膠質(zhì)瘤患者CSF和細(xì)胞上清中的差異表達(dá)，尚未見文獻(xiàn)報道。
　　結(jié)論:我們首次發(fā)現(xiàn)，基于CSF蛋白質(zhì)組的熱穩(wěn)定性，快捷簡便的DSC檢測具有提示膠質(zhì)瘤惡性程度的能力，而疾病狀態(tài)下多種高豐度蛋白質(zhì)成分的改變可能是

17、Tm值改變的原因之一;由于DSC反映的是蛋白質(zhì)組整體（特別是高豐度組分）的特征，因此利用高通量、高分辨率的蛋白質(zhì)組質(zhì)譜平臺檢測疾病狀態(tài)相關(guān)的低豐度蛋白的改變，不失為DSC技術(shù)的有力互補(bǔ)。我們進(jìn)而首次對現(xiàn)有的膠質(zhì)瘤CSF質(zhì)譜研究進(jìn)行了系統(tǒng)綜述，不僅總結(jié)了已報道的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，而且還驗證了通過生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)的新的標(biāo)志物(如IL-6);我們最后還首次通過iTRAQ定量標(biāo)記質(zhì)譜技術(shù)對膠質(zhì)瘤CSF蛋白質(zhì)組進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)了CNDP1、PD

18、IA4、QSOX1、PF4、SFRP3和VCL等在GBM與其它惡性度較低膠質(zhì)瘤之間存在差異表達(dá)的蛋白分子，而上述發(fā)現(xiàn)均未見文獻(xiàn)報道。這些膠質(zhì)瘤相關(guān)的低豐度差異蛋白，其來源可能是腫瘤組織、腫瘤微環(huán)境或是機(jī)體反應(yīng)性表達(dá)、分泌或釋放進(jìn)入CSF，不僅有望成為GBM患者CSF中的生物學(xué)標(biāo)志物，而且也值得進(jìn)一步研究闡明其起到的生物學(xué)功能。當(dāng)然，質(zhì)譜技術(shù)也有著昂貴、耗時費(fèi)力等不足，因此可以充分利用DSC技術(shù)快捷簡便的優(yōu)點(diǎn)予以互補(bǔ)，本課題因此也為今后對