黃瓜霜霉病菌對(duì)烯肟菌酯的室內(nèi)抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及抗藥性菌株的分子檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、本研究以專性寄生菌黃瓜霜霉病菌(Pseudoperonosporacubensis(Berk.etCert.)Rostr.)為靶標(biāo)菌，探討其不同發(fā)育階段對(duì)烯肟菌酯的敏感性，確定了烯肟菌酯對(duì)黃瓜霜霉病菌的毒力測(cè)定方法，并建立了黃瓜霜霉病菌對(duì)烯肟菌酯的敏感基線；進(jìn)行了該病原菌對(duì)烯肟菌酯的室內(nèi)抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及田間抗藥性檢測(cè)；研究了黃瓜霜霉病菌對(duì)烯肟菌酯產(chǎn)生抗藥性的分子機(jī)制，由此建立了抗藥性菌株的分子檢測(cè)方法。獲得以下研究結(jié)果： 1.黃瓜

2、霜霉病菌不同發(fā)育階段對(duì)烯肟菌酯的敏感性結(jié)果表明，烯肟菌酯對(duì)黃瓜霜霉病菌的休止孢萌發(fā)沒(méi)有抑制作用，對(duì)黃瓜霜霉病菌的游動(dòng)孢子釋放、游動(dòng)孢子游動(dòng)、芽管伸長(zhǎng)、菌絲擴(kuò)展、孢子囊梗形成、孢子囊產(chǎn)生均有抑制作用，而且對(duì)黃瓜霜霉病菌的孢子囊釋放、游動(dòng)孢子游動(dòng)和芽管伸長(zhǎng)有顯著的抑制作用。基于藥劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)有抑制作用，對(duì)休止孢的萌發(fā)沒(méi)有影響，并綜合考慮試驗(yàn)方法的可操作性和穩(wěn)定、準(zhǔn)確性，推薦使用葉碟保濕法測(cè)定烯肟菌酯對(duì)菌絲擴(kuò)展的EC50，以建立霜霉病菌對(duì)烯肟

3、菌酯的敏感基線。 2.從北京、天津、內(nèi)蒙古、湖北等未使用過(guò)烯肟菌酯和同類殺菌劑的黃瓜栽培地采集52株黃瓜霜霉病菌，采用葉碟保濕法測(cè)定其對(duì)烯肟菌酯的敏感性。結(jié)果表明，EC50分布于0.0030μg/ml-0.0313μg/ml之間，平均EC50為(0.0101±0.0031)μg/ml。不同菌株對(duì)烯肟菌酯的敏感性頻率分布呈連續(xù)單峰曲線，接近正態(tài)分布，尚未出現(xiàn)敏感性下降的抗藥性群體，因此可以采用供試菌株的平均EC50作為黃瓜霜霉病菌

4、對(duì)烯肟菌酯的敏感基線，并用于田間抗藥性監(jiān)測(cè)。 3.室內(nèi)抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估表明，采用紫外誘變和藥劑馴化的方法誘導(dǎo)均可獲得抗烯肟菌酯的突變體，EC50分布于1.0-5.0μg/ml，抗藥性指數(shù)為80～502倍。其中紫外誘變方法較藥劑馴化方法更易于獲得抗藥性突變體，且其抗性水平高于藥劑馴化方法。部分生物學(xué)性狀研究顯示，突變體的抗藥性狀穩(wěn)定，其致病力、適合度和競(jìng)爭(zhēng)力與親本敏感菌株相比沒(méi)有明顯差異或優(yōu)于親本菌株。烯肟菌酯與腈嘧菌酯之間存在正交

5、互抗藥性，與氟嗎啉、霜脲氰和甲霜靈之間均無(wú)交互抗藥性。綜合分析表明，黃瓜霜霉病菌對(duì)烯肟菌酯具有較高的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)，在田間自然情況下抗藥性菌株可能形成優(yōu)勢(shì)菌群，建議生產(chǎn)上應(yīng)將烯肟菌酯與其它無(wú)交互抗性的藥劑交替使用或混合使用，以避免或延緩抗藥性的產(chǎn)生。 4.田間抗藥性監(jiān)測(cè)試驗(yàn)表明，隨著施藥次數(shù)的增加，黃瓜霜霉病菌對(duì)烯肟菌酯的敏感性略有下降，試驗(yàn)中監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)兩株低抗藥性菌株，抗性倍數(shù)分別為4.76、3.84。 5.病原菌抗藥性分子

6、機(jī)制研究結(jié)果表明，與敏感菌株線粒體Cytb基因部分氨基酸序列比對(duì)，田間低抗菌株氨基酸序列中77位由Leu突變?yōu)镸et(L77M)；室內(nèi)抗藥性突變體CR1，CR4，CR6氨基酸突變位點(diǎn)相同，均為氨基酸序列的113位由Ala突變?yōu)镚ly(A113G)，143位由Gly突變?yōu)锳la(G143A)。在Cytb基因片段中，143位氨基酸發(fā)生突變的抗性菌株的核苷酸序列是GCTGC，為Fnu4HI的酶切位點(diǎn)。進(jìn)一步通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)分析了藥劑靶標(biāo)位點(diǎn)

7、Cytb基因結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明L77和A113均不在烯肟菌酯的結(jié)合區(qū)域內(nèi)，而且這兩個(gè)氨基酸的突變也沒(méi)有使Cytb基因結(jié)合區(qū)域的結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化，因此推測(cè)黃瓜霜霉病菌線粒體中Cytb基因的143位氨基酸的突變是靶標(biāo)菌對(duì)烯肟菌酯產(chǎn)生抗性的主要原因。 6.建立了抗藥性菌株的分子檢測(cè)方法。采用AS-PCR和CAPS方法進(jìn)行抗藥性菌株的檢測(cè)，可獲得與傳統(tǒng)生物測(cè)定方法相同的檢測(cè)結(jié)果。與傳統(tǒng)方法相比，分子檢測(cè)方法可縮短檢測(cè)時(shí)間、提高檢測(cè)效率，因