ROS-RhoA在幽門螺桿菌誘導(dǎo)MKN-45細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架重排中的作用.pdf

1、胃癌是目前全世界死亡人數(shù)最多的惡性腫瘤之一，侵襲轉(zhuǎn)移是影響胃癌預(yù)后的重要因素。H.pylori感染是誘導(dǎo)胃癌發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素，也是促進(jìn)胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞侵襲和遷移能力的增加是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵原因，肌動(dòng)蛋白骨架重排是腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力增加的重要標(biāo)志，因此肌動(dòng)蛋白骨架的重排有可能在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。通過(guò)文獻(xiàn)回顧，發(fā)現(xiàn)Rho GTP酶家族的RhoA蛋白在肌動(dòng)蛋白骨架重排中起重要作用，而RhoA在許多

2、腫瘤中都高表達(dá)，且H.pylori感染能夠促進(jìn)RhoA蛋白活性，同時(shí)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H.pylori感染能夠誘導(dǎo)胃癌上皮細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架的變化?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）是生物體中需氧細(xì)胞在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一系列氧代謝產(chǎn)物，有研究發(fā)現(xiàn)ROS能夠調(diào)控RhoA活性，而H.pylori在感染時(shí)能產(chǎn)生大量ROS。H.pylori、肌動(dòng)蛋白骨架、RhoA及ROS之間關(guān)系到底如何，并沒(méi)有明確地實(shí)驗(yàn)說(shuō)明。因此，假設(shè)H

3、.pylori通過(guò)ROS/RhoA來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架重排來(lái)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　目的：1、觀察H.pylori感染對(duì)MKN-45細(xì)胞形態(tài)學(xué)及肌動(dòng)蛋白骨架的影響；2、研究H.pylori感染對(duì)MKN-45細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響；3、探討RhoA蛋白在H.pylori誘導(dǎo)MKN-45細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架變化及在侵襲和遷移中的作用；4、探討H.pylori感染MKN-45細(xì)胞后所產(chǎn)生的ROS對(duì)RhoA蛋白

4、活性的影響。
　　方法：1、H.pylori與MKN-45細(xì)胞共培養(yǎng)，制作H.pylori體外感染MLN-45細(xì)胞模型，倒置相差顯微鏡觀察MKN-45細(xì)胞被感染后形態(tài)學(xué)改變，phalloidin染色觀察肌動(dòng)蛋白骨架的變化；2、Transwell法檢測(cè)H.pylori對(duì)MKN-45細(xì)胞侵襲力的影響，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)H.pylori對(duì)MKN-45細(xì)胞遷移能力的影響；3、RT-PCR法檢測(cè)H.pylori感染后不同時(shí)間點(diǎn)（0min、15mi

5、n、30min、60min、180min、360min）RhoA mRNA表達(dá)量；GST及western-blot法檢測(cè)RhoA蛋白活性。4、siRNA方法干擾RhoA表達(dá)，通過(guò)phalloidin染色、transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)H.pylori感染后肌動(dòng)蛋白骨架及侵襲力的影響。5、流式細(xì)胞儀檢測(cè)H.pylori感染后不同時(shí)間點(diǎn)（0min、15min、30min、60min、180min、360min）ROS的表達(dá)；NAC干預(yù)（60mi

6、n）H.pylori感染的MKN-45細(xì)胞后，檢測(cè)ROS下降對(duì)RhoA蛋白活性的影響。
　　結(jié)果：1、H.pylori（MOI100：1）與MKN-45共培養(yǎng)后，MKN-45細(xì)胞顯著伸長(zhǎng)并有突起伸出，分散生長(zhǎng)，細(xì)胞間連接減少，呈現(xiàn)典型“蜂鳥(niǎo)表型”；phalloidin對(duì)F-actin染色后發(fā)現(xiàn)，伸長(zhǎng)結(jié)構(gòu)及突起為肌動(dòng)蛋白骨架，分析細(xì)胞長(zhǎng)徑與寬徑比值（L/B）后發(fā)現(xiàn)，H.pylori感染組比值為4.82±1.165，而PBS對(duì)照組比值

7、為1.28±0.22；2、Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，100倍鏡下，H.pylori感染組穿膜細(xì)胞數(shù)為1600.5±109.6，而PBS對(duì)照組為491.0±58.6，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；劃痕實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，H.pylori感染組劃痕愈合面積為15.1±2.8％，而PBS對(duì)照組為4.9±2.3％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；3、RT-PCR檢測(cè)H.pylori感染MKN-45細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)（0min、15min、30min

8、、60min、180min、360min）RhoA mRNA表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)mRNA表達(dá)量并不隨時(shí)間遞增，GST和western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RhoA蛋白活性（RhoA-GTP/total RhoA）隨時(shí)間依次遞增；4、應(yīng)用RNAi干擾MKN-45細(xì)胞RhoA表達(dá)后，Transwell實(shí)驗(yàn)顯示MKN-45RhoA+PBS對(duì)照組穿膜細(xì)胞為54.3±6.1個(gè)，MKN-45RhoA+H.pylori組為65.0±7.6個(gè)，兩者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

9、（P＞0.05）；phalloidin染色顯示，RhoA表達(dá)下降后，MKN-45細(xì)胞形態(tài)多為不規(guī)則形，細(xì)胞間連接少，H.pylori感染后，只有少部分細(xì)胞伸長(zhǎng)變型，MKN-45RhoA+PBS對(duì)照組L/B結(jié)果為1.5±0.18倍，MKN-45RhoA+H.pylori組結(jié)果為1.73±0.85，兩者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；5、流式細(xì)胞儀（DCFH-DA探針）檢測(cè)H.pylori感染MKN-45細(xì)胞后各時(shí)間點(diǎn)（0min、15mi

10、n、30min、60min、180min、360min）ROS熒光強(qiáng)度，結(jié)果顯示熒光強(qiáng)度隨感染時(shí)間依次增強(qiáng)；NAC預(yù)處理MKN-45細(xì)胞1h后（特異抑制ROS），H.pylori感染MKN-45細(xì)胞6h后RhoA蛋白活性為0.57±0.05，PBS+H.pylori感染組蛋白活性為0.82±0.03，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：1、H.pylori感染在體外能夠促進(jìn)胃癌上皮細(xì)胞的伸長(zhǎng)變型及肌動(dòng)蛋白骨架的重排，且H