載ACEshRNA-PEG殼聚糖納米粒的制備以及對自發(fā)性高血壓大鼠的治療作用.pdf

1、目的：首先制備殼聚糖納米粒，并且給予PEG表面修飾，分析其相關(guān)物理學(xué)、生物學(xué)特性，以期獲得一種緩釋的非病毒載體介導(dǎo)系統(tǒng)，其次行培養(yǎng)的大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染，觀察其轉(zhuǎn)染效率，細(xì)胞毒性等，并從分子蛋白水平觀察對ACE基因的下調(diào)作用，最后以篩選出的合適劑量轉(zhuǎn)染自發(fā)性高血壓大鼠，觀察降壓療效以及對靶器官的影響等生物效應(yīng)。 方法： 1.載ACEshRNA-PEG—殼聚糖納米粒制備以及生物學(xué)特性。 1)應(yīng)用本實驗室前期實驗中篩

2、選出的能顯著下調(diào)ACE基因的靶序列：5'—AACCTAACATGTCAGCCTCTG-3'(基因序列位點3603-3624)，由武漢晶賽公司協(xié)助合成質(zhì)粒，采用菌液用堿裂解法大量抽提和純化重組質(zhì)粒，隨機(jī)酶切測序，并檢測質(zhì)粒濃度與純度。 2)采用離子交聯(lián)法制備殼聚糖納米粒，PEG修飾殼聚糖納米粒，復(fù)凝聚法制備不同PH值、體積比以及PEG化的載ACEshRNA殼聚糖納米。噴金電鏡下對各種殼聚糖納米粒懸液掃描并照相，觀察納米粒與形態(tài)。同

3、時使用zeta電位儀測定其顆粒大小、zeta電位值和多分散度。應(yīng)用凝膠阻滯分析驗證載ACEshRNA殼聚糖納米多聚復(fù)合物的形成及電荷性質(zhì)。紫外分光光度計檢測離心后上清液中DNA的含量，計算包埋率，繪制PEG—CS/DNA納米復(fù)合物累積釋放曲線，以及分析納米粒對核酸酶的抗性。 2．載ACEshRNA-PEG—殼聚糖納米粒對血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的篩選。 1)組織貼塊法體外培養(yǎng)大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞，免疫熒光法檢測胞漿Ⅷ因子進(jìn)行鑒定

4、，臺盼蘭染色檢測細(xì)胞成活率。 2)分別以較佳配比率(納米粒：質(zhì)粒為1：1)結(jié)合的CS-dNA納米復(fù)合物組以及PEG—CS-dNA納米復(fù)合物60ul、80ul、100ul、120ul轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮細(xì)胞0-96h，并以相應(yīng)的裸質(zhì)粒組以及空白組作為對照。 3)熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞綠色熒光的表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率，MTT法測定細(xì)胞活性。 3．載ACEshRNA-PEG—殼聚糖納米粒轉(zhuǎn)染體系抑制大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞AC

5、E表達(dá)的研究。 1)應(yīng)用Real—time熒光定量PCR檢測各組PEG—CS-dNA納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染前后ACEmRNA的表達(dá)．并以裸質(zhì)粒和空白組為對照。 2)于轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染后的24h、48h、72h收集各組細(xì)胞，用Western—blot法檢測ACE蛋白的表達(dá)。 3)于轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染后的72h收集培養(yǎng)液2mL，用酶聯(lián)免疫方法檢測ACE以及Ang—Ⅱ的含量。 4．載ACEshRNA-PEG—殼聚糖納米粒轉(zhuǎn)染體系

6、介導(dǎo)RNAi對自發(fā)性高血壓大鼠的影響。 1)研究對象為12周齡成年雄性自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)和高血壓模型對照鼠，采用尾靜脈注射DNA含量為25ug，無菌生理鹽水稀釋后500ul載ACEshRNA-PEG—殼聚糖納米復(fù)合物，10天重復(fù)給藥一次。并以每日灌胃給予洛丁新10mg/日/只作為對照，同時設(shè)SHR空白對照組、殼聚糖對照組以及正常血壓對照組，分別尾靜脈注射500ul無菌生理鹽水或相同濃度的殼聚糖納米液。 2)分別于

7、注射前及注射后每1-3天的相同時間點采用尾袖法在安靜環(huán)境中測量大鼠清醒狀態(tài)下尾動脈收縮壓(SBP)和心率。 3)熒光定量RT-PCR或Western—blot法檢測心肌、主動脈、腎臟ACEmRNA或蛋白的表達(dá)，并應(yīng)用酶聯(lián)免疫法檢測各組血清ACE以及Ang—Ⅱ含量的變化，全自動生化分析儀檢測肝腎功能。 4)實驗結(jié)束時，行左側(cè)頸動脈插管測定左心室功能血流動力學(xué)檢查，并稱取全心(HW)、左室重量(LW)，求全心/體重、左心室/

8、體重比值，并且制備心、腎及主動脈組織冰凍切片，熒光顯微鏡下檢測載ACEshRNA-PEG—殼聚糖納米粒的分布，光鏡以及透射電鏡行心肌組織學(xué)檢查。 結(jié)果： 1．載ACEshRNA-PEG—殼聚糖納米粒制備以及生物學(xué)特性。 1.1 經(jīng)紫外分光光度計檢測質(zhì)粒DNA濃度為0.5ug/ul，純度為1.88。 1.2 各因素對殼聚糖納米復(fù)合物理化性質(zhì)的影響。 1.3 各因素對殼聚糖與質(zhì)粒結(jié)合力的影響。

9、 1.4各因素對復(fù)合物包埋率的影響。 1.5 各因素對復(fù)合物體外釋放的影響。 1.6 DNaseⅠ消化實驗。 2．載ACEshRNA-PEG—殼聚糖納米粒對血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的篩選。 2.1 免疫熒光法鑒定證實培養(yǎng)獲得穩(wěn)定的大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞存活率達(dá)95％以上。 2.2 轉(zhuǎn)染效率的測定。 2.3 各轉(zhuǎn)染條件下載ACEshRNA-PEG—殼聚糖納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞毒性的測定。 3

10、．載ACEshRNA-PEG—殼聚糖納米粒轉(zhuǎn)染體系抑制大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞ACE表達(dá)的研究。 3.1 轉(zhuǎn)染前后不同組ACE基因mRNA表達(dá)的變化。 3.2 轉(zhuǎn)染前后不同組細(xì)胞ACE蛋白表達(dá)的變化。 3.3 血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中ACE以及Ang—Ⅱ的含量。 4．載ACEshRNA-PEG—殼聚糖納米粒轉(zhuǎn)染體系介導(dǎo)RNAi對自發(fā)性高血壓大鼠的影響。 4.1 治療前后尾動脈壓及心率的變化。 4.2

11、PEG—CS—EGFP—ACE—shRNA的組織器官分布情況。 4.3 PEG—CS—EGFP—ACE—shRNA轉(zhuǎn)染72h后對心，腎，主動脈的ACE功能的下調(diào)作用：1)RT-PCR結(jié)果。 4.4 對左室結(jié)構(gòu)以及功能的影響。 4.5 對肝腎功能的影響。 結(jié)論： 1. 所制備的載ACE—shRNA-PEG—殼聚糖納米大小均勻，粒徑分布范圍較窄。并且篩選出在PH=5.5時，與質(zhì)粒體積比為1：1時，以P

12、EG殼聚糖納米粒作為基因載體有良好的DNA包埋率，體外釋藥反應(yīng)呈現(xiàn)緩釋的特性，并且能有效地抑制核酸酶對質(zhì)粒DNA的降解，為后期體外轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞以及體內(nèi)轉(zhuǎn)染提供了實驗基礎(chǔ)。 2．經(jīng)過轉(zhuǎn)染條件的篩選以及對殼聚糖納米的PEG表面修飾，找到了較佳轉(zhuǎn)染條件：DNA25μg、DNA：CS納米粒體積比為1：1，轉(zhuǎn)染72小時為較大轉(zhuǎn)染效率。 3．本實驗合成的載ACEshRNA-PEG—CS納米轉(zhuǎn)染體系介導(dǎo)的RNA干擾，在體外培養(yǎng)的大鼠血

13、管內(nèi)皮細(xì)胞中成功發(fā)揮了ACE基因表達(dá)下調(diào)作用以及抑制ACE與Ang—Ⅱ的合成等生物學(xué)效應(yīng)，證明了PEG—CS/DNA轉(zhuǎn)染載體可以有效地將目的基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞并且發(fā)揮相應(yīng)的基因下調(diào)以及功能學(xué)效應(yīng)。 4．PEG—CS納米粒介導(dǎo)的ACE—shRNA經(jīng)尾靜脈注射入自發(fā)性高血壓大鼠體內(nèi)后，成功發(fā)揮了基因沉默作用，有效抑制了ACEmRNA及相應(yīng)功能蛋白的表達(dá)，與傳統(tǒng)長效ACEI類藥物相比，降壓幅度更大、一次給藥可以維持10天左右降壓效果，并且