熱休克蛋白90抑制劑17-AAG抗腎細胞癌作用的機制研究.pdf

1、第一部分 HIF-2α、Hsp90和VEGF在腎細胞癌中的表達及臨床意義 目的:研究腎細胞癌中缺氧誘導因子2(HIF-2α)、熱休克蛋白90(Hsp90)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達及與臨床病理特征之間的關系，并探討三者之間及與腎細胞癌患者預后的關系。 方法:應用免疫組織化學(IHC)S-P法檢測60例腎細胞癌及25例正常腎組織中HIF-2α、Hsp90和VEGF表達與分布，分析其間的相關性及與腫瘤臨床病理特征之

2、間的聯(lián)系，根據(jù)隨訪資料探討上述三者與腎細胞癌患者預后的關系。應用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和免疫印跡(western blot)法檢測HIF-2α及VEGF mRNA的表達。 結果:免疫組化S-P法檢測中腎細胞癌標本HIF-2α、Hsp90和VEGF的表達明顯高于正常腎組織，差別具有統(tǒng)計學意義。三個指標之間，兩兩呈顯著正相關。HIF-2α、Hsp90和VEGF的表達與腎癌的分期、淋巴轉移、腫瘤大小及局部侵潤有關。上述三者

3、與腎細胞癌患者生存期之間關系的分析提示HIF-2α陰性組腎細胞癌患者的生存率高于陽性組，差異有統(tǒng)計學意義，Hsp90陰性組生存率有高于陽性組的趨勢，接近于統(tǒng)計學水平，VEGF陽性組病例的預后顯著差于陰性組，有統(tǒng)計學意義。RT-PCR和western blot法檢測中HIF-2α只在蛋白水平增高，VEGF在mRNA和蛋白水平均增高。 結論:在人腎細胞癌中HIF-2α、Hsp90和VEGF基因高表達，且HIF-2α、Hsp90和VE

4、GF三者表達之間有顯著正相關。HIF-2α和VEGF是影響腎細胞癌預后的獨立因素。HIF-2α可能通過上調(diào)VEGF表達而在腎細胞癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Hsp90與HIF-2α密切相關，可能二者在腎細胞癌的發(fā)生發(fā)展中共同作用。 第二部分 Hsp90抑制劑17-AAG對人腎癌細胞生物學行為影響的體外研究 目的:觀察Hsp90抑制劑17-AAG對體外培養(yǎng)的人腎癌細胞株Caki-1細胞的作用。 方法:將Hsp90抑制

5、劑17-AAG加入人腎癌細胞株Caki-1中(實驗組)，分別在常氧和缺氧狀態(tài)下進行培養(yǎng)。同時設立陰性對照組和空白對照組。MTT法檢測三組細胞增殖能力。Hoechst33342和PI雙染法觀察細胞凋亡，AnnexinV-FITC/PI雙染法和DNA ladder檢測細胞凋亡。western blot法檢測HIF-2α和VEGF蛋白表達。 結果:對數(shù)生長周期的三組細胞在常氧狀態(tài)下的增殖活性無明顯區(qū)別。而實驗組細胞在缺氧48小時后生長

6、能力逐漸下降，細胞增殖明顯滯后于前兩組細胞，差異有統(tǒng)計學意義。缺氧狀態(tài)下實驗組的凋亡率明顯增高，而陰性對照組和空白對照組細胞的凋亡率盡管也增多，但增高幅度較小，與實驗組比較，差異有統(tǒng)計學意義。常氧狀態(tài)下，實驗組細胞HIF-2α和VEGF蛋白表達受到抑制，明顯低于陰性對照組和空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義。在模擬缺氧24小時后，陰性對照組和空白對照組的HIF-2α和VEGF蛋白表達明顯增強，與常氧時比較差異有統(tǒng)計學意義。而實驗組細胞HIE-

7、2α和VEGF蛋白表達雖然有所增加，但幅度較小，與常氧時比較差異無統(tǒng)計學意義。 結論:在體外，Hsp90抑制劑17-AAG能抑制Caki-1細胞增殖，促進凋亡，并能抑制人腎癌細胞株Caki-1的HIF-2α和VEGF基因表達。 第三部分 Hsp90抑制劑17-AAG對人腎細胞癌抑制作用的體內(nèi)研究 目的:在整體水平(裸鼠皮下移植瘤)研究Hsp90抑制劑17-AAG對人腎細胞癌生長的作用。 方法:建立人腎細胞

8、癌裸鼠皮下移植瘤模型，在模型中按125mg/kg體重標準，在瘤體內(nèi)分別注射17-AAG、DMSO和生理鹽水，觀察抑瘤效果，IHC S-P法檢測HIF-2α和VEGF蛋白表達，TUNEL和透視電鏡檢測凋亡。 結果:實驗組裸鼠皮下移植瘤的生長明顯受到抑制。體積增長明顯慢于空白對照組和陰性對照組，差別有統(tǒng)計學意義。同時重量明顯輕于空白對照組和陰性對照組，差別有統(tǒng)計學意義。實驗組裸鼠皮下移植瘤HIF-2α和VEGF蛋白表達弱于對照組，差