脂聯素通過血管外膜干預脂多糖介導的氮氧化應激的實驗研究.pdf

1、脂聯素受體在血管外膜及血管外膜成纖維細胞中表達的研究
　　 本研究的目的：1探討脂聯素受體在血管外膜及血管外膜成纖維細胞上的表達情況；2在炎癥狀態(tài)下，血管外膜成纖維細胞表達脂聯素受體的變化。通過這一研究，為進一步研究脂聯素通過血管外膜發(fā)揮抗炎和抗動脈粥樣硬化作用奠定基礎。
　　 方法：1細胞培養(yǎng)：剝脫小鼠胸主動脈的外膜，用組織貼塊法進行原代細胞培養(yǎng)，當達到80-90融合時傳代，實驗采用第4-8代細胞。分別用α-SM-ac

2、tin單抗(1：200)和波形蛋白(Vimentin)單抗(1：300)和二抗TRITC(1：100)進行免疫細胞熒光染色，鑒定所培養(yǎng)的細胞是否是所需要的AF及其純度。2實驗分組：
　　 (1)根據LPS的刺激濃度分組
　　 (2)根據LPS的不同刺激時間分組
　　 3 RT-PCR：觀察正常血管外膜組織、骨骼肌組織及肝組織脂聯素受體的表達及正常及LPS刺激后，血管外膜成纖維細胞(AFs)上AdipoR1及Adi

3、poR2的表達，采用“2-△△CT方法”分析基因的表達量。
　　 4蛋白印跡分析：觀察正常血管外膜組織、骨骼肌組織及肝組織脂聯素受體的表達及正常及LPS刺激后，AFs上AdipoR1及AdipoR2的表達。強弱用表達的蛋白和β-actin條帶積分光密度的比值表示。
　　 5免疫細胞熒光染色：觀察正常及LPS刺激后，FITC和TRITC二抗標記的α-SM-actin、vimentin、AdipoR1及AdipoR2在AF中

4、的表達，用IOD比較它們在不同分組間表達的強弱。
　　 結果：
　　 1 AF的孵育和鑒定：
　　 2脂聯素和脂聯素受體的表達：
　　 3 LPS刺激下脂聯素受體1的表達：
　　 創(chuàng)新性及局限性：
　　 1.創(chuàng)新點
　　 (1)應用RT-PCR、western blot及免疫細胞熒光等多種方法證實了血管外膜成纖維細胞上存在著脂聯素受體，尤其是脂聯素受體1，在國內外未見報道。

5、　　 (2)在LPS刺激下，血管外膜成纖維細胞脂聯素受體1表達降低，呈時間和劑量依賴性。
　　 2.局限性
　　 (1)因技術所限，未能對脂聯素受體進行進一步的功能研究。
　　 (2)未對脂聯素受體在炎癥刺激下表達降低的機制進行進一步的探討。
　　 結論：
　　 (1)正常血管外膜及血管外膜成纖維細胞可以表達脂聯素受體，其中脂聯素受體1高表達，脂聯素受體2低表達，而血管外膜成纖維細胞幾乎不表達脂

6、聯素。提示脂聯素可能通過旁分泌途徑作用于血管外膜成纖維細胞。
　　 (2)血管外膜成纖維細胞脂聯素受體1的表達量與LPS刺激濃度和時間呈負相關。
　　 背景：
　　 本研究目的：1探討脂聯素對LPS誘導的血管外膜成纖維細胞遷移、增殖及肌化的影響；2探討脂聯素對LPS誘導的血管外膜成纖維細胞iNOS、ONOO-及NO的影響；3探討脂聯素發(fā)揮上述作用的可能信號轉導通路。研究結果將為更深入地研究脂聯素對血管的作用途徑和

7、作用機制奠定理論基礎。
　　 方法：
　　 1體內實驗：
　　 1.1動物實驗：
　　 90只10-12周齡的雄性apoE-/-小鼠實驗全程高脂飲食喂養(yǎng)。
　　 1.2血清脂聯素濃度分析：利用大鼠抗人脂聯素ELISA試劑盒分析高脂飼料apoE-/-小鼠轉染腺病毒前后血清脂聯素濃度。
　　 1.3 AS斑塊的超聲影像學形態(tài)特征：應用顯微超聲技術測量斑塊面積。
　　 1.4生化指標檢測

8、：取實驗前后全部動物眼球后采血，測定血脂濃度。
　　 1.5一氧化氮生成檢測：取實驗前后全部動物眼球后采血，測定血清中一氧化氮濃度。
　　 1.6病理學檢測：頸動脈斑塊組織學切片分別行蘇木素一伊紅染色，免疫組織化學染色觀察iNOS和ONOO-的局部表達。
　　 2體外實驗：
　　 2.1細胞培養(yǎng)：同論文I。
　　 2.2實驗分組
　　 2.2.1根據APN的刺激濃度分組
　　 2.

9、2.2根據有無siRNA-AdipoR1轉染及AMPK抑制劑分組
　　 2.3 siRNA干擾AF AdipoR1蛋白表達的檢測：western blot檢測轉染細胞β-actin， AdipoR1的蛋白質表達水平。
　　 2.4 MTT試驗：觀察APN和LPS刺激后，AF在不同時間點的增殖能力。
　　 2.5劃痕法和transwell法：觀察APN和LPS刺激后，AF在不同時間點的遷移能力。
　　 2.

10、6一氧化氮生成檢測：觀察APN和LPS刺激后，AF生成一氧化氮的變化。
　　 2.7 RT-PCR:觀察APN和LPS刺激后，iNOS和β-actin的表達，采用“2-ΔΔCT方法”分析基因的表達量。
　　 2.8蛋白印跡分析：觀察APN和LPS刺激后，iNOS、nitrotyrosine、p-AMPK、p-ACC和β-actin的表達。強弱用表達的蛋白和β-actin條帶積分光密度的比值表示。
　　 2.9免疫

11、細胞熒光染色：觀察APN和LPS刺激后，FITC和TRITC二抗標記的α-SM-actin在AF中的表達，用IOD比較它們在不同分組間表達的強弱。
　　 結果：
　　 1體內試驗
　　 1.1動物的基本特征
　　 1.2血清脂聯素濃度
　　 1.3 AS斑塊影像學特征
　　 1.4脂聯素對血脂的影響
　　 1.5脂聯素對血清N0的影響與轉染前和外膜局部轉染Ad-GFP比較，NO濃度

12、明顯降低。
　　 1.6脂聯素對血管壁iNOS和ONOO-的影響與轉染前和外膜局部轉染Ad-GFP比較，iNOS和ONOO-的表達明顯降低。
　　 2體外實驗
　　 2.1 AF的孵育和鑒定：同論文I。
　　 2.2 siRNA干擾AF AdipoR1蛋白表達的效果應用不同濃度siRNA-AdipoR1轉染AF進行RNAi，western blot檢測AdipoR1的表達隨轉染濃度的增加逐漸減低，而β-a

13、ctin的表達不受影響。
　　 2.3 APN和LPS對AF增殖的影響
　　 (1)LPS對AF增殖的影響：通過MTT試驗證實，與正常細胞對照組相比，LPS促進AF的增殖。
　　 (2)APN對AF增殖的影響：通過MTT試驗進行OD值的比較，APN不影響正常AF細胞的增殖能力。與LPS組相比，APN+LPS組0D值下降。與APN+LPS組相比，siRNA-adipoR1+APN+LPS組和Compound C+A

14、PN+LPS組0D值升高。
　　 2.4 APN和LPS對AF遷移的影響
　　 (1)LPS對AF遷移的影響：劃痕實驗顯示隨著LPS刺激時間的延長，LPS導致的AF的遷移能力逐漸增加。
　　 (2)APN對AF遷移的影響：與LPS組相比，APN+LPS組AF遷移距離和遷移細胞數減少。
　　 2.5 APN和LPS對AF向MF轉化的影響
　　 (1)LPS對AF向MF轉化的影響：與正常細胞相比，LP

15、S導致AFα-SM-actin單抗染色陽性的細胞數逐步增加。
　　 (2)APN對AF向MF轉化的影響：與LPS組相比，APN+LPS組AFα-SM-actin單抗染色陽性的細胞數減少。
　　 2.6 APN和LPS對AF一氧化氮生成的影響
　　 (1)LPS對AF一氧化氮的影響：正常情況下，AF產生少量的一氧化氮；加入LPS刺激后，AF一氧化氮的產生增加。
　　 (2)APN對AF一氧化氮的影響：與LP

16、S組相比，APN+LPS組AF產生的N0減少。
　　 2.7 APN和LPS對AF iNOS和ONOO-表達的影響：
　　 與LPS組相比，APN+LPS組AFiNOS和ONOO-的表達降低(P均＜0.01)。與APN+LPS組相比，siRNA-adipoR1+APN+LPS組.和Compound C+APN+LPS組AFiNOS和ONOO-的表達升高(P均＜0.01)。
　　 2.8 AF一氧化氮產生的信號轉導

17、通路通路的影響：
　　 與LPS組相比，APN+LPS組和APN組AF的p-AMPK和p-ACC的表達增加(P均＜0.01)。與APN+LPS組相比，siRNA-adipoR1+APN+LPS組和Compound C+APN+LPS組AF的p-AMPK和p-ACC的表達降低(P均＜0.01)。
　　 結論：
　　 1血管外膜局部轉染Ad-APN后血清血脂水平下降，體重減輕，說明脂聯素可通過外膜局部干預發(fā)揮改善代謝

18、的作用。
　　 2血管外膜局部轉染Ad-APN后，血清過度增高的NO濃度明顯下降，血管壁iNOS和ONOO-表達降低。提示脂聯素可能通過抑制iNOS和ONOO-的表達來發(fā)揮外膜抗動脈粥樣硬化作用。
　　 3體外實驗證實，LPS對AF的遷移、增殖和肌化均有促進作用，而APN能夠有效地抑制LPS對AF的遷移、增殖和肌化的促進作用。
　　 4體外實驗證實LPS能夠激活AF的iNOS，使NO和ONOO-產生增加，而APN