小八角蓮活性成分提取分離、質(zhì)量控制及藥效研究.pdf

1、中藥活性成分研究是當前藥學(xué)領(lǐng)域的熱點課題。采用現(xiàn)代化學(xué)手段開展中藥活性成分質(zhì)量控制、提取分離和藥效研究是中藥現(xiàn)代化研究的重要內(nèi)容。小八角蓮是小檗科八角蓮屬植物，在湖南省廣泛分布，根和根莖入藥，具有清熱解毒，散結(jié)祛瘀功效，用于治療淋巴結(jié)炎、腮腺炎和肺炎等，療效確切。但關(guān)于小八角蓮的相關(guān)研究十分少見。為了充分發(fā)揮湖南資源特色，深入開發(fā)利用小八角蓮植物資源優(yōu)勢，本論文從化學(xué)成分、質(zhì)量控制、活性成分提取分離和藥效評價等方面對小八角蓮開展了較系統(tǒng)

2、而全面的研究，獲得了一批較有價值的研究成果，為小八角蓮植物資源產(chǎn)業(yè)化利用打下了堅實基礎(chǔ)。
　　 1、首次開展小八角蓮化學(xué)成分研究，并明確了主要化學(xué)成分。
　　 應(yīng)用現(xiàn)代色譜技術(shù)對小八角蓮的乙醇提取物進行了系統(tǒng)的分離，從中分離得到了木脂素、黃酮類等共6種化合物，通過經(jīng)典的化學(xué)方法和各種現(xiàn)代波譜學(xué)技術(shù)(UV，IR，EI-MS，F(xiàn)AB-MS，1H-NMR，13C-NMR等)進行了結(jié)構(gòu)鑒定。木脂素類成分主要為鬼臼毒素和4’-去甲

3、基鬼臼毒素。黃酮類成分主要為山奈酚、槲皮素、槲皮苷和蘆丁。以上6種化學(xué)成分均為首次從小八角蓮中分離得到。
　　 2、系統(tǒng)研究小八角蓮質(zhì)量控制，并制訂質(zhì)量標準草案。
　　 依據(jù)《中國藥典》，對小八角蓮來源、性狀、鑒別、檢查和含量測定等質(zhì)量控制項目進行了系統(tǒng)研究。確定了小八角蓮的來源與性狀特征；建立了小八角蓮粉末顯微鑒別和活性成分一鬼臼毒素和槲皮素的薄層色譜鑒別方法；明確了小八角蓮檢查雜質(zhì)不得過2％，水分不得過15％，重金屬

4、不得過百萬分之五，砷鹽不得過百萬分之二；采用高效液相色譜法建立了小八角蓮活性成分鬼臼毒素含量測定方法，以C18為固定相，甲醇-0.1％磷酸水(60:40)為流動相，室溫，流速1.0ml/min，檢測波長為292nm，線性范圍0.20～2.00μg相關(guān)系數(shù)r=0.9999，平均加樣回收率為100.23％，RSD為0.99％。在此基礎(chǔ)上，制訂了小八角蓮質(zhì)量標準草案。
　　 3、首次開展小八角蓮指紋圖譜研究，考察不同產(chǎn)地小八角蓮整體性

5、化學(xué)表征差異。
　　 建立了小八角蓮HPLC色譜指紋圖譜研究方法：以甲醇為提取溶媒，采用超聲波提取法制各樣品溶液。檢測波長254 nm，其他色譜條件與含量測定相同。該方法所得指紋圖譜穩(wěn)定性好、響應(yīng)峰多、吸收強、特征明顯，所測組分均達到基線分離，可作為小八角蓮指紋圖譜研究方法。以湖南、湖北、貴州等7個產(chǎn)區(qū)的131批藥材為材料，對不同供試品所得指紋圖譜進行分析，共標定了13個特征峰。將樣品色譜圖與對照品色譜圖進行比對，可確定1號峰、

6、3號峰、7號峰、10號峰和12號峰分別為蘆丁、槲皮苷、槲皮素、鬼臼毒素和山奈酚。指紋圖譜相似度采用自主開發(fā)的“色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”進行計算，全國不同產(chǎn)地小八角蓮樣品的平均相似度為0.965±0.018。
　　 采用主成分分析法(PCA)分析表明：藥材指紋圖譜相似度大小與其產(chǎn)地有關(guān)，地理位置越接近，藥材相似度越高。
　　 4、開展木脂素類活性成分鬼臼毒素提取分離研究，獲得了鬼臼毒素制備新工藝。
　　 采用乙

7、醇回流提取和CO2超臨界萃取法，開展木脂素類活性成分鬼臼毒素提取工藝研究。結(jié)果，醇回流提取小八角蓮提取率顯著高于CO2超臨界萃取法。鬼臼毒素最佳提取工藝是，以80％乙醇為提取溶媒，沸水浴連續(xù)回流提取2次，第一次加9倍量溶媒，提取60分鐘，第二次加7倍量溶媒，提取45分鐘。
　　 采用大孔樹脂分離技術(shù)分離純化木脂素類活性成分鬼臼毒素。大孔樹脂分離純化最佳條件為：選擇HPD-100、LSA-5B和HPD-400大孔吸附樹脂作為上柱樹

8、脂，上樣濃度為4.81mg/ml(相當于原生藥)，先以蒸餾水，10％乙醇除去雜質(zhì)，再有70％乙醇洗脫，收集70％乙醇洗脫部分。鬼臼毒素在總固形物中的百分含量可達8096以上。
　　 5、研究鬼臼毒素抗胃癌SGC7901細胞株的作用，為鬼臼毒素用于臨床治療胃癌提供依據(jù)。
　　 不同濃度的鬼臼毒素(0，5，10，20和50μ g/ml)處理SGC7901細胞后，采用MTT比色法和平板克隆形成實驗檢測細胞的增殖；采用流式細胞術(shù)

9、檢測細胞周期分布和細胞凋亡；裸鼠成瘤實驗檢測鬼臼毒素對SGC7901細胞體內(nèi)致瘤能力的影響。
　　 鬼臼毒素呈時間與劑量依賴性抑制SGC7901細胞生長，并明顯降低SGC7901細胞平板克隆；鬼臼毒素明顯誘導(dǎo)SGC7901細胞凋亡，并使SGC7901細胞阻滯于G2/M期；鬼臼毒素顯著降低SGC7901細胞裸鼠移植瘤的體積及重量。
　　 鬼臼毒素能抑制胃癌SGC7901細胞的生長，誘導(dǎo)SGC7901細胞凋亡，并能抑制GC7