眼前房Foxp3+Treg細(xì)胞與角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:研究眼前房?jī)?nèi)Foxp3+Treg細(xì)胞與角膜移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的關(guān)系及c-rel因子對(duì)角膜移植術(shù)后前房Foxp3+Treg細(xì)胞分化的調(diào)控作用。
　　 方法:建立小鼠穿透性角膜移植術(shù)(PKP)模型。40只BALB/c小鼠隨機(jī)分為二組:同種異系PKP組(A組)和原位PKP組(B組),術(shù)后裂隙燈觀察各組是否有植片免疫排斥發(fā)生及排斥時(shí)間。病理學(xué)檢測(cè)術(shù)后7天及14天時(shí)各組角膜植片及虬膜睫狀體內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)情況;免疫熒光法檢測(cè)術(shù)后7天及

2、14天時(shí)各組植片及虹膜睫狀體內(nèi)CD4+細(xì)胞、IL-17+細(xì)胞及Foxp3+Treg細(xì)胞的表達(dá);Real-time RT-PCR檢測(cè)術(shù)后7大及14天時(shí)各組角膜及虹膜睫狀體內(nèi)CD4+T細(xì)胞的啞群Treg細(xì)胞的特征性轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)及c-rel的mRNA表達(dá)水平;Western Blot檢測(cè)術(shù)后7天及14天時(shí)各組角膜及虹膜睫狀體內(nèi)Treg細(xì)胞的特征性轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)及Th17細(xì)胞特征性細(xì)胞因子(IL-17)的蛋白表達(dá)水平;流式細(xì)胞

3、術(shù)檢測(cè)術(shù)后14天時(shí)各組眼內(nèi)CD4+T細(xì)胞、CD25+T細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞表達(dá)水平及Foxp3免疫熒光強(qiáng)度。
　　 結(jié)果:A組植片發(fā)生免疫排斥的平均時(shí)間為14.0±1.15天,B組未見(jiàn)免疫排斥反應(yīng)發(fā)生。組織病理學(xué)顯示A組及B組術(shù)后7天時(shí)角膜緣、前房角內(nèi)及虹膜睫狀體組織多量炎細(xì)胞浸潤(rùn),可見(jiàn)炎細(xì)胞粘附丁二角膜內(nèi)皮。術(shù)后14天,A組角膜植片大量炎細(xì)胞浸潤(rùn),角膜內(nèi)皮可見(jiàn)炎性細(xì)胞附著,大量新生血管長(zhǎng)入植片。免疫

4、熒光示術(shù)后7天A組及B組角膜及虹膜睫狀體組織CD4、IL-17、Foxp3表達(dá)均增多,并可見(jiàn)CD4+IL-17+細(xì)胞攻擊角膜內(nèi)皮。術(shù)后14天,A組角膜及虹膜組織大量表達(dá)CD4、IL-17及Foxp3;B組角膜及虹膜組織散在表達(dá)CD4及IL-17,角膜及虹膜睫狀體Foxp3表達(dá)最較術(shù)后7天無(wú)明顯差別。Real-time RT-PCR示術(shù)后7天及14天,A組角膜及虹膜睫狀體組織Foxp3 mRNA、CD25mRNA及c-rel mRNA表達(dá)

5、鼉均顯著升高,B組僅術(shù)后7天Foxp3 mRNA、CD25mRNA及c-rel mRNA表達(dá)量顯著升高,術(shù)后14天表達(dá)量回落;術(shù)后7天A組角膜及虹膜睫狀體IL-17mRNA表達(dá)量明顯增高,術(shù)后14天降低,B組術(shù)后角膜及虹膜睫狀體組織IL-17mRNA表達(dá)量始終保持在低水平。分析Foxp3mRNA/IL-17mRNA的比率發(fā)現(xiàn),此比率術(shù)后7天時(shí),B組明顯高于A組。C-relmRNA在各組、各時(shí)間點(diǎn)的變化趨勢(shì)與Foxp3mRNA一致。Wes

6、tern Blot示術(shù)后14天,A組及B組角膜及虹膜睫狀體組織Foxp3蛋白表達(dá)量均較7天時(shí)顯著升高;A組術(shù)后14天角膜及虹膜睫狀體組織IL-17蛋白表達(dá)量顯著增高,B組IL-17蛋白表達(dá)量始終保持在低水平。Foxp3蛋白/IL-17蛋白比率在B組明顯高于A組。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)示:術(shù)后14天,A組小鼠眼組織CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞2.6％,Foxp3平均熒光強(qiáng)度為58.557;B組小鼠眼組織CD4+CD2

7、5+Foxp3+Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞1.117％,Foxp3平均熒光強(qiáng)度為114.444。
　　 結(jié)論:角膜移植術(shù)后,眼前房免疫微環(huán)境發(fā)生的極大的改變,這一環(huán)境的變化誘導(dǎo)了大量Foxp3+Treg細(xì)胞、IL-17+Th17細(xì)胞等活化的淋巴細(xì)胞在眼組織局部浸潤(rùn),其中Treg細(xì)胞起了主要的促免疫耐受作用,不同的免疫微環(huán)境中聚集的Treg細(xì)胞具有不同的Foxp3表達(dá)量,其中高表達(dá)Foxp3的Treg細(xì)胞具有更強(qiáng)的免疫抑制功能;