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文檔簡介
1、我國約有300多萬因角膜病致盲的患者,角膜移植術(shù)尤其是穿透性角膜移植術(shù)是這些患者的重要復(fù)明手段。角膜移植術(shù)是目前同種器官移植中成功率最高的一種組織移植手術(shù),對(duì)眼部條件好的病例,術(shù)后第1年的排斥率僅為10%,但對(duì)于病情復(fù)雜的高危角膜移植病人(High-riskkeratoplastypatients)如:受體眼表新生血管化、持續(xù)炎癥、結(jié)角膜化學(xué)傷、大植片移植、第二次移植等病人,雖通過HLA配型或局部和全身應(yīng)用免疫抑制性藥物等方法,術(shù)后角膜
2、移植片的存活率仍小于35%。因此如何提高有高危因素眼的角膜移植術(shù)后存活率已成為目前臨床亟待解決的問題,而尋找高效低毒的免疫抑制劑是解決此問題的研究熱點(diǎn)之一。目前以新一代高效免疫抑制劑環(huán)胞霉素A(CsA)為主的免疫抑制療法已經(jīng)在臨床得到廣泛應(yīng)用。但是,CsA毒副作用如肝、腎毒性及有限的治療效果,并未從根木上解決問題。且價(jià)格昂貴,長期應(yīng)用給患者及其家屬帶來一定的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。近20年來,研究開發(fā)新型、高效、低毒、價(jià)廉的免疫抑制劑,一直是各國學(xué)者
3、關(guān)注的熱點(diǎn)。為了提高角膜移植術(shù)后植片存活率,減輕毒副反應(yīng),使植片長期存活,我們從祖國古老的中醫(yī)藥寶庫中選擇了具有顯著免疫抑制效果而毒副作用輕微的中藥青藤堿進(jìn)行研究,近年來,發(fā)現(xiàn)青藤堿(smomenine)有顯著的抑制免疫反應(yīng)作用,是一種有效的免疫抑制劑。全身應(yīng)用青藤堿已證明對(duì)防治實(shí)驗(yàn)性大鼠腎臟移植術(shù)后的排斥反應(yīng)有明顯的對(duì)抗效應(yīng),但尚未見用于角膜移植排斥反應(yīng)的報(bào)道。 青藤堿(sinomenine)是從中藥青風(fēng)藤(Sinomeniu
4、m、cutumRehd.etWils.)中提取的生物堿單體,藥用多為其鹽酸鹽。以往研究表明它具有較強(qiáng)的抗炎、鎮(zhèn)痛及免疫抑制作用.主要用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療。 青藤堿具有很強(qiáng)的免疫抑制作用,它能顯著降低腎移植大鼠外周血中T淋巴細(xì)胞,且主要是抑制CD4+T細(xì)胞,使CD4+/CD8+比值下降,并與CsA有協(xié)同作用.其作用機(jī)制可能與CsA的作用環(huán)節(jié)有相似之處。TH1細(xì)胞主要分泌IFNγ、IL2、TNF。TH2細(xì)胞主要分泌IL4、IL5
5、、IL6、IL10,而兩類細(xì)胞的功能主要由不同的細(xì)胞因子介導(dǎo)。IFNγ、TNFα、IL2、IL12、IL18通常被稱為是TH1類細(xì)胞因子.TH1細(xì)胞活化后分泌的IFNγ、TNFα等能夠激活巨噬細(xì)胞、CD4+細(xì)胞,而這些細(xì)胞又可導(dǎo)致DTH.青藤堿對(duì)T淋巴細(xì)胞活化及對(duì)TH1類細(xì)胞因子釋放的抑制作用可能有助于角膜移植排斥反應(yīng)的緩解。 本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠穿透性角膜移植模型,觀察鹽酸青藤堿對(duì)角膜移植排斥反應(yīng)的影響以及角膜植片LC和黏附分子
6、ICAM-1的表達(dá),從而研究鹽酸青藤堿的作用機(jī)制,為臨床角膜移植免疫治療提供更好的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究目的: 1.檢測(cè)正常角膜組織表面LC及ICAM-1表達(dá)的部位及強(qiáng)度,為相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。 2.建立大鼠同種異體穿透性角膜移植模型,通過檢測(cè)不同濃度鹽酸青藤堿對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)植片LC及ICAM-1表達(dá)的影響,從抗原提呈及協(xié)同刺激角度探討新型免疫抑制劑鹽酸青藤堿抑制角膜移植排斥反應(yīng)的可能機(jī)制,并對(duì)不同濃度組作出比較。
7、 3.對(duì)比觀察新型免疫抑制劑鹽酸青藤堿與CsA抑制角膜移植免疫排斥反應(yīng)的效果,分析其作用機(jī)理。 研究方法: 1.正常大鼠角膜組織中LC及ICAM-1的表達(dá):取健康清潔級(jí)正常Wistar大鼠,過量麻醉致死后立即摘除眼球,取其正常角膜,制作石蠟切片。HE染色,光鏡下觀察正常角膜組織形態(tài)學(xué)特征,免疫組織化學(xué)染色(SABC法)檢測(cè)LC及ICAM-1在正常角膜組織的表達(dá)及分布情況。 2.角膜移植術(shù)后觀察不同濃度的鹽酸青藤堿
8、滴眼液對(duì)角膜移植排斥反應(yīng)的影響及鹽酸青藤堿滴眼液的免疫抑制效果:制作大鼠同種異體穿透性角膜移植模型,以健康清潔級(jí)Wistar大鼠為供體,SD大鼠為受體,設(shè)生理鹽水處理組(Ⅰ組),0.5%SIN滴眼液治療組(Ⅱ組),1%SIN滴眼液治療組(Ⅲ組),分別于術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)(5天,7天,10天)取角膜植片,制作石蠟切片,HE染色,光鏡下觀察各組角膜植片病理學(xué)改變,免疫組織化學(xué)染色(SABC法)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)LC及ICAM-1在各組角膜組織的表達(dá)
9、及分布情況,SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,比較各組之間的差異。 3.以健康清潔級(jí)Wistar大鼠為供體,SD大鼠為受體,設(shè)生理鹽水對(duì)照組(Ⅰ組),0.5%SIN滴眼液治療組(Ⅱ組),1%SIN滴眼液治療組(Ⅲ組),1%CsA滴眼液治療組(Ⅳ組),1%SIN滴眼液與1%CsA滴眼液聯(lián)合用藥組(Ⅴ組),對(duì)比觀察新型免疫抑制劑鹽酸青藤堿與CsA抑制角膜移植免疫排斥反應(yīng)的效果,分析其作用機(jī)理。 研究結(jié)果: 1.正常
10、大鼠角膜組織LC及ICAM-1的表達(dá):LC主要存在于周緣角膜組織上皮細(xì)胞基底層,而中央部缺乏該細(xì)胞的表達(dá);ICAM-1主要表達(dá)在角膜上皮層,基質(zhì)層及內(nèi)皮層表達(dá)極弱。 2.不同濃度鹽酸青藤堿對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)角膜植片LC及ICAM-1表達(dá)的影響: (1)急性排斥期角膜植片HE染色結(jié)果顯示:生理鹽水處理組(Ⅰ組)角膜植片顯著增厚,大量單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤。0.5%SIN組次之,1%SIN組植片水腫混濁明顯減輕。 (2)在
11、角膜移植術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)角膜植片各層蛋白表達(dá)均增高,植片傷口及縫線附近的上皮層及淺層基質(zhì)增高更為明顯。與正常大鼠角膜組織相比,生理鹽水處理組表達(dá)最為明顯,0.5%SIN組次之,1%SIN組較少。 (3)各移植組大鼠在觀察期內(nèi)(3W內(nèi))全部發(fā)生急性排斥反應(yīng),排斥反應(yīng)發(fā)生率為100%。各組平均生存時(shí)間為:生理鹽水處理組(11.00±0.74)d,0.5%SIN組(14.42±0.99)d,1%SIN組(17.17±1.40)d,1%C
12、sA組(16.58±0.79)d,聯(lián)合用藥組(20.08±1.24)d。 (4)1%SIN組植片生存時(shí)間、同種異體角膜移植術(shù)后10d排斥反應(yīng)指數(shù)與對(duì)照組比較有顯著差異(P=0.000,P=0.000);和1%CsA組比較無顯著差別(P=0.860,P=0.185),聯(lián)合用藥組參數(shù)明顯優(yōu)于單一用藥各組。 結(jié)論: 1.LC主要在正常大鼠角膜緣上皮細(xì)胞基底層表達(dá),基質(zhì)層缺乏淋巴細(xì)胞表達(dá);ICAM-1主要表達(dá)于角膜上皮細(xì)
13、胞層,在基質(zhì)層及內(nèi)皮層表達(dá)極弱;在角膜移植術(shù)后不同點(diǎn)各層表達(dá)均增高,與以往研究結(jié)果一致,該研究結(jié)果提示LC及ICAM-1與角膜移植免疫有著密切的關(guān)系。 2.LC及ICAM-1參與角膜移植免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生,鹽酸青藤堿可以通過特異性抑制LC及ICAM-1在植片中的表達(dá),從而抑制大鼠角膜移植免疫排斥反應(yīng),延長角膜植片生存時(shí)間。 3.1%SIN組對(duì)角膜排斥反應(yīng)的抑制作用優(yōu)于0.5%SIN組,各個(gè)用藥組無明顯抑制新生血管的作用。
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