組織工程竇房結(jié)體外構(gòu)建初探.pdf

1、目的：對(duì)乳豬竇房結(jié)的所在部位進(jìn)行準(zhǔn)確的定位，建立一套可靠的竇房結(jié)細(xì)胞取材、分離、純化培養(yǎng)技術(shù)。在成功培養(yǎng)乳豬竇房結(jié)細(xì)胞的基礎(chǔ)上選取竇房結(jié)細(xì)胞作為種子細(xì)胞，以膠原纖維膜為支架材料進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，在體外構(gòu)建組織工程竇房結(jié)的雛形。 方法：(1)竇房結(jié)細(xì)胞的取材：取出生24h內(nèi)乳豬5只，氯胺酮(ketamine，10mg/kg)麻醉，依次用酒精、碘伏消毒胸腹部皮膚、沿胸骨正中切開(kāi)皮膚，剪開(kāi)胸骨，并用乳突牽開(kāi)器牽開(kāi)，再用眼科剪分離心包膜、胸

2、腺，暴露整個(gè)心臟至上腔靜脈。輕牽移右心耳，看清上腔靜脈，用多導(dǎo)電生理記錄儀的2根雙極電極在竇房結(jié)區(qū)域(上腔靜脈與右心房交界處周?chē)?用蛙跳方式反復(fù)標(biāo)測(cè)記錄電活動(dòng)，尋找房波最早出現(xiàn)的位置。在該位置插入銀針一枚，取下整個(gè)心臟，然后在解剖顯微鏡下圍繞銀針周?chē)?.5mm×1.5mm×1mm的組織塊放入PBS(0.01mmol/L)中。將所取乳豬的竇房結(jié)組織進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，隨機(jī)分兩組：常規(guī)方法培養(yǎng)和純化培養(yǎng)。 (2)心房肌細(xì)胞的取材：在

3、解剖顯微鏡下，在取下的整個(gè)心臟的左心房部位取1.5mm×1.5mm×1mm的組織塊放入PBS(0.01mmol/L)中。 (3)竇房結(jié)細(xì)胞純化培養(yǎng)：將組織塊用PBS液洗滌3次以后剪碎；加入0.25％胰酶和0.1％膠原酶Ⅱ各2ml，放入孵箱孵育15min，棄上清液；加入0.25％胰酶和0.1％膠原酶Ⅱ各2ml后置于37℃水浴中振蕩15min，再吹打1～2min，自然沉淀1～2min；吸取細(xì)胞懸液移入另一支離心管中，加等體積含20％

4、胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止胰酶消化。重復(fù)消化5次至組織塊基本消化成單細(xì)胞為止；將收集的細(xì)胞懸液離心(1500轉(zhuǎn)/min)，棄上清液；再用含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基沈細(xì)胞一次，離心，棄上清液；加入含20％胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基(含青霉素100IU/ml，鏈霉素100μg/ml)，打散細(xì)胞團(tuán)為單細(xì)胞懸液；調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)/ml，將單細(xì)胞懸液接種于一次性培養(yǎng)瓶中置于37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)90min后，采用差速貼壁分

5、離技術(shù)，吸收培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液，收集至一次性培養(yǎng)皿中，調(diào)整5'-bromodeoxyuridine(5-BrdU)濃度為0.1mmol/L放入孵箱培養(yǎng)；每天用含0.1mmol/L5-BrdU的含20％胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基換液，共5天。 (4)同樣的方法純化培養(yǎng)心房肌細(xì)胞以作對(duì)比。 (5)竇房結(jié)細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)法培養(yǎng)：方法同上，只是不采用差速貼壁技術(shù)及5-BrdU處理，以作對(duì)比。 (6)竇房結(jié)細(xì)胞與膠原纖維支架

6、的復(fù)合培養(yǎng)：純化培養(yǎng)竇房結(jié)細(xì)胞的方法在細(xì)胞接種一次性培養(yǎng)皿以前同上，將細(xì)胞懸液濃縮后滴加于經(jīng)預(yù)濕處理的支架材料上，用含0.1mmol/L5-BrdU的含20％胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基換液5天后做電鏡和HE染色光鏡觀察。 (7)全部數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。 結(jié)果：(1)用多導(dǎo)電生理記錄儀的雙極電極探測(cè)到的房波最早出現(xiàn)的位置就是竇房結(jié)所在部位，其中80.77％位于界溝上1/3腔耳角的外側(cè)，11.54％位于界

7、溝上1/3腔耳角上，7.69％位于界溝上1/3腔耳角的內(nèi)側(cè)(P＜0.01)。 (2)純化培養(yǎng)的竇房結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)至第5天，經(jīng)倒置顯微鏡觀察，見(jiàn)培養(yǎng)的竇房結(jié)細(xì)胞有三種形態(tài)，即梭形、三角形與不規(guī)則形，其中梭形細(xì)胞最多，同期對(duì)照培養(yǎng)的心房肌細(xì)胞主要為三角形及不規(guī)則形，而無(wú)梭形細(xì)胞。培養(yǎng)竇房結(jié)細(xì)胞中梭形細(xì)胞較三角形細(xì)胞小(P＜0.01)，而搏動(dòng)頻率較三角形細(xì)胞快(P＜0.01)；竇房結(jié)的三角形細(xì)胞的大小及搏動(dòng)頻率與心房肌的三角形細(xì)胞均無(wú)顯著

8、差異(P＞0.05)；三角形細(xì)胞在培養(yǎng)的心房肌細(xì)胞中所占比例明顯高于在培養(yǎng)竇房結(jié)細(xì)胞中所占比例(P＜0.01)。 (3)純化培養(yǎng)與常規(guī)培養(yǎng)比較，其貼壁時(shí)間、單細(xì)胞開(kāi)始搏動(dòng)的時(shí)間以及細(xì)胞接觸匯合時(shí)間都有所延遲，但梭形細(xì)胞所占比例明顯增加(P＜0.01)，而不規(guī)則形細(xì)胞明顯減少(P＜0.01)，三角形細(xì)胞無(wú)明顯差異。 (4)細(xì)胞懸液滴加于經(jīng)預(yù)濕處理的支架材料上后迅速均勻地?cái)U(kuò)散到支架內(nèi)。培養(yǎng)早期難以直接觀察到細(xì)胞的粘附以及生長(zhǎng)

9、情況。種植8h后膜外可見(jiàn)大量竇房結(jié)細(xì)胞粘附于培養(yǎng)皿底部，生長(zhǎng)良好。接種24h后，倒置顯微鏡下支架材料半透明，隱約可見(jiàn)細(xì)胞團(tuán)吸附于支架孔隙壁。培養(yǎng)5天后，HE染色光鏡觀察可見(jiàn)膠原纖維支架材料中有大量細(xì)胞。掃描電鏡觀察可見(jiàn)細(xì)胞成團(tuán)地吸附于支架表面及孔隙側(cè)壁，并可見(jiàn)細(xì)胞間通過(guò)突起相互連接，或伸出偽足貼附于支架孔隙壁上。竇房結(jié)細(xì)胞和膠原纖維支架復(fù)合良好。 結(jié)論：(1)乳豬的竇房結(jié)大多數(shù)位于界溝上1/3腔耳角的外側(cè)。 (2)通過(guò)準(zhǔn)