共培養(yǎng)技術(shù)用于體外構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本論文包括二個(gè)部分:
　　一、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與人軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)
　　目的:探索人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs)與人軟骨細(xì)胞(human Articular Chontrocytes,hACs)的體外分離及培養(yǎng)過(guò)程,并對(duì)其進(jìn)行鑒定;嘗試?yán)棉D(zhuǎn)化因子β1(Transforming growth factorβ1,TGF-β1)誘導(dǎo)hBM

2、SCs向軟骨細(xì)胞分化。
　　方法:取5~8歲兒童四肢長(zhǎng)骨骨折需髓內(nèi)釘固定者,抽吸其鉆孔后流出的骨髓,通過(guò)分離、離心獲得細(xì)胞,采用低糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行體外培養(yǎng),采取流式細(xì)胞儀對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定;使用倒置顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀況,繪制 hBMSCs生長(zhǎng)曲線。利用TGF-β1誘導(dǎo)hBMSCs向軟骨細(xì)胞分化。對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行阿利新藍(lán)染色、蕃紅花-亮綠染色檢測(cè)細(xì)胞蛋白聚糖﹙Aggrecan,GAG),免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)II型膠原

3、。
　　取多指(趾)患兒切除下來(lái)的關(guān)節(jié)軟骨,分離、消化獲得軟骨細(xì)胞,鑒定同hBMSCs誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞。
　　結(jié)果:hBMSCs呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng),約2ml骨髓中獲得的hBMSCs經(jīng)10天左右可長(zhǎng)滿(mǎn)六孔板的一孔。傳代后,其第一代~第五代生長(zhǎng)旺盛,培養(yǎng)至二十代漸出現(xiàn)凋亡。第三代 hBMSCs經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè) CD34、CD45表達(dá)陰性,CD29表達(dá)陽(yáng)性。利用TGF-β1誘導(dǎo)后的hBMSCs其阿利新藍(lán)、蕃紅花-亮綠及免疫組化II型膠原染色

4、表達(dá)陽(yáng)性。
　　多指(趾)軟骨細(xì)胞2周長(zhǎng)滿(mǎn)六孔板的一孔。鑒定結(jié)果同 hBMSCs誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞。
　　結(jié)論:1、在體外成功分離、培養(yǎng)了hBMSCs和hACs。
　　2、hBMSCs可來(lái)源于5~8歲兒童四肢長(zhǎng)骨骨髓。
　　3、成功利用轉(zhuǎn)化因子β1誘導(dǎo)hBMSCs分化成軟骨細(xì)胞。
　　二、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與人軟骨細(xì)胞共混培養(yǎng)體外構(gòu)建組織工程軟骨
　　目的:研究 hACs與 hBMSCs直接接觸共培養(yǎng)的最佳

5、比例;比較混合培養(yǎng)與TGF-β1誘導(dǎo)hBMSCs體外構(gòu)建組織工程軟骨的效果。
　　方法:取上述分離培養(yǎng)后第三代hBMSCs和第三代hACs以2:1、1:1、1:2的比例共培養(yǎng)并接種于絲素蛋白支架(實(shí)驗(yàn)組A、B、C)。同時(shí)建立誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)第三代hBMSCs向軟骨細(xì)胞分化并接種于絲素支架的對(duì)照組D;建立單純第三代hACs接種于絲素支架的對(duì)照組 E。保持各組細(xì)胞總數(shù)一致。將細(xì)胞-支架復(fù)合物進(jìn)行體外培養(yǎng)3周,采用倒置顯微鏡、大體形態(tài)、組織學(xué)

6、HE染色、II型膠原染色、阿利新藍(lán)比色法測(cè)GAG含量及Hoechst33258熒光法行DNA定量分析進(jìn)行觀察。
　　結(jié)果:各組細(xì)胞在絲素蛋白三維支架上均生長(zhǎng)良好;各組細(xì)胞支架復(fù)合物外觀大小無(wú)明顯差異。A組(hBMSCs:hACs=2:1)與 D組(TGF-β1誘導(dǎo)組)形成的細(xì)胞支架復(fù)合物彈性、光澤較差,組織學(xué)染色見(jiàn)細(xì)胞增殖少,細(xì)胞外基質(zhì)分泌水平較低, GAG與DNA定量分析結(jié)果低于其他三組。C組(hBMSCs:hACs=1:2)構(gòu)

7、建的細(xì)胞支架復(fù)合物具有最佳的彈性與光澤,組織學(xué)染色見(jiàn)細(xì)胞支架結(jié)合緊密,細(xì)胞增殖較多,胞外基質(zhì)豐富,GAG與DNA定量分析結(jié)果最高。B組(hBMSCs:hACs=1:1)與E組(單純hACs組)體外構(gòu)建的組織工程軟骨質(zhì)量相當(dāng)。
　　結(jié)論:1、hBMSCs與 hACs之間的相互作用有利于軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生,比例為2:1時(shí)即可獲得與TGF-β1誘導(dǎo)hBMSCs相當(dāng)?shù)某绍浌切?yīng)。
　　2、hBMSCs與hACs直接接觸共培養(yǎng)比例為