Ⅰ型咪唑啉受體候選蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、本課題組近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)I型咪唑啉受體(I1R)可能是調(diào)節(jié)阿片依賴的重要分子之一,并提出了胍丁胺——I1R構(gòu)成的作用系統(tǒng)可能是又一新的阿片功能調(diào)節(jié)系統(tǒng)這一學(xué)術(shù)觀點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外研究表明,I1R候選蛋白(Imidazoline Receptor Antisera Selected protein,IRAS)可能是I1R或至少是I1R的重要功能亞基之一。然而,本課題組前期利用自制單克隆抗體對(duì)大鼠組織中IRAS分布進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn),除肝臟外,其它組織均

2、未檢測(cè)到全長(zhǎng)形式(167KDa)的表達(dá),且IRAS的胞內(nèi)囊泡狀亞細(xì)胞定位與放射自顯影檢測(cè)的I1R的細(xì)胞膜分布存在矛盾,I1R不同配體藥理學(xué)作用也存在較大的差異。本課題組前期研究表明,IRAS可能存在多種可變剪接體形式,提出了“I1R的上述科學(xué)問(wèn)題可能與存在的多種可變剪接體有關(guān)”的假說(shuō)。
　　本課題擬首先應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)I1R可能存在的可變剪接體及可能發(fā)生剪接的位置,虛擬研究可變剪接體的分子構(gòu)成和功能;在此生物信息學(xué)研究的基礎(chǔ)上,

3、用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)對(duì)IRAS進(jìn)行短截突變,擴(kuò)增與預(yù)測(cè)可變剪接體有相似功能結(jié)構(gòu)域的短截突變體,并構(gòu)建相應(yīng)的真核表達(dá)載體;從亞細(xì)胞定位和分子量特征兩方面初步了解短截突變體的結(jié)構(gòu)與功能,以此推測(cè)I1R可變剪接體的功能;在此基礎(chǔ)上,結(jié)合本課題組前期研究,克隆GenBank號(hào)為AK036043(本課題中命名為Nischarin472)和AK086880(Nischarin334)兩個(gè)剪接體,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體建立穩(wěn)定表達(dá)IRAS、IRA

4、S1-826(短截突變體)、Nischarin472和Nischarin334基因的CHO細(xì)胞模型,并從與I1R配體結(jié)合特性、I1R激動(dòng)劑對(duì)MAPK通路的激活及對(duì)細(xì)胞周期的影響三個(gè)方面深入探索剪接體的結(jié)構(gòu)與功能。
　　研究結(jié)果:
　　1、對(duì)人IRAS和小鼠Nischarin同源蛋白進(jìn)行搜索,篩選出其mRNA具有完整開放閱讀框(有起始密碼子及終止密碼子)和具有polyA尾部部分或全部特征的同源蛋白,對(duì)其同源蛋白的氨基酸序列和m

5、RNA序列分別與 IRAS/Nischarin蛋白序列和基因序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果表明人IRAS可能存在8個(gè)可變剪接體,其GenBank或Eensembl蛋白質(zhì)序列ID號(hào)分別為 BAG63739.1、 CAB55920.1、 ENSP00000417812、 EAW65228.1、ENSP00000392484、BAG51306.1、ENSP00000410462、EAW65228.1。小鼠Nischarin可能存在6個(gè),其GenBank蛋

6、白質(zhì)序列ID號(hào)分別是BAC37917.1、AAH03270.1、BAC25092.1、BAC39757.1、BAC29286.1、AAG42100.1。上述蛋白的mRNA序列與IRAS/Nischarin基因序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果表明,IRAS/Nischarin存在選擇性起始、選擇性終止、內(nèi)含子保留、外顯子跳躍等多種剪接方式;其可能存在的剪接位置主要在IRAS的第121aa、392aa、512aa、1152aa氨基酸殘基處,此外可能還存在

7、稀有剪接位置如246aa、472aa、657aa等氨基酸殘基處;IRAS/Nischarin選擇性起始剪接(多個(gè)異位啟動(dòng))表明IRAS/Nischarin基因可能存在多個(gè)啟動(dòng)子。上述預(yù)測(cè)結(jié)果為I1R剪接體結(jié)構(gòu)與功能的探索奠定了基礎(chǔ),提供了方向。
　　2、根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果,應(yīng)用PCR法克隆了11個(gè)與預(yù)測(cè)剪接體有相似功能結(jié)構(gòu)域的短截突變體,采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞內(nèi)。應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光法探索亞細(xì)胞定位結(jié)果表明,

8、在轉(zhuǎn)染 IRAS全長(zhǎng)的細(xì)胞系上,IRAS亞細(xì)胞分布呈胞內(nèi)囊泡狀,這種分布特征需要PX結(jié)構(gòu)域與SR或CC結(jié)構(gòu)域共同作用。IRAS在細(xì)胞內(nèi)以多聚體形式存在(同源或異源),提示 I1R在體內(nèi)可能也以多聚體形式存在。在 IRAS的512aa～826aa氨基酸殘基范圍內(nèi)存在核定位信號(hào),提示某些I1R剪接體可能參與了基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。應(yīng)用western-blot方法探索分子量特征,實(shí)驗(yàn)表明,SR及CC結(jié)構(gòu)域?qū)Φ鞍追肿恿坑绊懞艽?含有這兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域的短

9、截突變體分子量比預(yù)測(cè)分子量大20KDa～50KDa,進(jìn)一步佐證I1R在體內(nèi)可能不是單體形式。
　　3、在結(jié)構(gòu)與功能初步探索的基礎(chǔ)上,成功克隆了Nischarin472和Nischarin334兩個(gè)可變剪接體。結(jié)果表明,Nischarin472剪接方式是內(nèi)含子保留,而Nischarin334是外顯跳躍。其亞細(xì)胞定位均為胞內(nèi)彌散分布,分子量與預(yù)測(cè)分子量基本一致。Nischarin472在大多數(shù)組織中均有表達(dá),且外周組織器官表達(dá)高于腦內(nèi)

10、。
　　4、其后,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體建立了穩(wěn)定表達(dá) IRAS、IRAS1-826、Nischarin472和Nischarin334基因的CHO細(xì)胞系。在細(xì)胞模型上, I1R激動(dòng)劑能激活穩(wěn)定表達(dá) IRAS和IRAS1-826細(xì)胞系MAPK通路中的ERK磷酸化升高,且這種效應(yīng)能被I1R拮抗劑依法克生抑制。在表達(dá)Nischarin472和Nischarin334細(xì)胞系中,I1R激動(dòng)劑不能上調(diào)ERK磷酸化水平;穩(wěn)定表達(dá)IRAS和IRAS

11、1-826基因的CHO細(xì)胞系能與I1R配體([3H]-可樂(lè)定)特異結(jié)合,且其結(jié)合有飽和性和可逆性,而在穩(wěn)定表達(dá)Nischarin472和Nischarin334的CHO細(xì)胞系上,未見其能與[3H]-可樂(lè)定的結(jié)合特性;細(xì)胞周期結(jié)果表明,穩(wěn)定表達(dá)IRAS和IRAS1-826蛋白的CHO細(xì)胞系可能對(duì)細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用,但Nischarin472和Nischarin334不具備此功能,相反在細(xì)胞受到損傷時(shí)可能加速細(xì)胞損傷。
　　結(jié)

12、論:
　　(1)IRAS亞細(xì)胞分布呈囊泡狀,PX、SR或CC結(jié)構(gòu)域共同作用決定此定位,LRR結(jié)構(gòu)域與C末端(826aa～1504aa)未見其對(duì)亞細(xì)胞定位的影響,512aa～826aa范圍內(nèi)存在核定位信號(hào),上述結(jié)果提示IRAS不同可變剪接體可能有不同的亞細(xì)胞定位;
　　(2)SR或CC結(jié)構(gòu)域?qū)RAS蛋白分子量影響較大,提示IRAS可能通過(guò)這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域與自身或剪接體相互作用而以多聚形式存在(其中可能還存在共價(jià)結(jié)合方式);