水稻空育131耐冷候選基因OsRBCS3的功能驗(yàn)證.pdf

1、水稻是我國(guó)及黑龍江省重要的糧食作物，黑龍江省地處中國(guó)最北端，是世界水稻栽培的北限，低溫冷害發(fā)生頻繁。冷害可導(dǎo)致水稻大幅度減產(chǎn)。不同水稻品種耐冷性不同，培育耐冷品種是防治低溫冷害最有效的措施。研究及克隆水稻耐冷的相關(guān)基因，有利于水稻耐冷育種工作。黑龍江省普通高等學(xué)校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了耐冷水稻空育131和冷敏感水稻龍粳11低溫脅迫數(shù)字表達(dá)譜。本研究根據(jù)低溫脅迫水稻數(shù)字表達(dá)譜，選取了與光合作用有關(guān)、低溫脅迫響應(yīng)基因OsRBCS3;分析

2、了在低溫脅迫下耐冷水稻空育131和冷敏感水稻龍粳11間OsRBCS3基因表達(dá)量;對(duì)比了OsRBCS3基因在空育131與龍粳11間的序列差異;構(gòu)建了水稻空育131 OsRBCS3基因的超量表達(dá)載體及CRISPR/Cas9敲除載體;通過遺傳轉(zhuǎn)化研究了空育131 OsRBCS3基因的功能。研究的主要結(jié)果包括:
　　1.耐冷水稻空育131及冷敏感水稻龍粳11孕穗期低溫脅迫后，空育131的OsRBCS3基因表達(dá)量上調(diào)幅度大于龍粳11。從空育

3、131和龍粳11中克隆的OsRBCS3基因序列相同，CDS區(qū)均為528bp，編碼175個(gè)氨基酸。兩個(gè)水稻品種耐冷性差異可能是OsRBCS3基因表達(dá)量的不同造成的。
　　2.通過Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建水稻空育131 OsRBCS3基因超量表達(dá)載體pGWB12-R3和pGWB18-R3。同時(shí)，構(gòu)建了水稻空育131 OsRBCS3基因的CRISPR/Cas9敲除載體pVK-R3。
　　3.采用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將含有水稻空育1

4、31的OsRBCS3基因的超量表達(dá)載體導(dǎo)入到冷敏感水稻龍粳11基因組中，分別獲得陽性轉(zhuǎn)基因株系L-12為9個(gè)，L-18為10個(gè)。通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)將耐冷材料水稻空育131的OsRBCS3基因敲除，獲得陽性轉(zhuǎn)基因株系KC為5個(gè)。
　　4.對(duì)轉(zhuǎn)OsRBCS3基因的龍粳11水稻進(jìn)行耐冷性鑒定，超量表達(dá)OsRBCS3基因的水稻株系耐冷性較受體品種龍粳11有所提高。
　　5.對(duì)陽性轉(zhuǎn)基因株系KC進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)，