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文檔簡介
1、低溫脅迫冷害是植物非生物脅迫中影響植物生長最重要的環(huán)境因素,也是全國以及中國東北地區(qū)導(dǎo)致作物大幅度減產(chǎn)的最普遍因素。通過對(duì)耐逆性分子機(jī)制的不斷研究,發(fā)現(xiàn)受低溫誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)生顯著改變的基因,為了提高植物的耐逆性采取轉(zhuǎn)基因技術(shù),從而改良植物抗逆境脅迫有重要的研究價(jià)值。
本研究通過芽期耐冷性鑒定確定空育131為水稻耐寒品種和龍粳11為水稻冷敏感品種,以其為研究對(duì)象,進(jìn)行基因表達(dá)譜分析,篩選出參與氨基糖和核苷酸糖代謝基因—幾丁質(zhì)酶(GH
2、18),該基因在低溫誘導(dǎo)下發(fā)生顯著改變。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)冷脅迫不同時(shí)間點(diǎn)的OsGH18基因進(jìn)行表達(dá)分析,通過Gateway克隆技術(shù),分別對(duì)耐冷品種空育131和冷敏感品種龍粳11中的OsG H18基因進(jìn)行克隆,并進(jìn)行了對(duì)水稻龍粳11的遺傳轉(zhuǎn)化,獲得轉(zhuǎn)基因植株。主要研究結(jié)果如下:
1.水稻空育131芽期低溫脅迫響應(yīng)基因的確定
分析表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)共有229個(gè)差異表達(dá)基因在四個(gè)低溫處理時(shí)間點(diǎn)均上調(diào)。Pathway分析發(fā)現(xiàn)
3、參與抗低溫脅迫主要有氨基糖和核苷酸糖代謝,滲透調(diào)節(jié),光合作用相關(guān)等代謝途徑。
2.水稻空育131芽期耐冷候選基因的確定
通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù),以0h為參照,對(duì)冷處理不同時(shí)間點(diǎn)的OsGH18基因進(jìn)行耐冷性表達(dá)分析,結(jié)果顯示,耐冷品種空育131的OsGH18基因高表達(dá),各處理時(shí)間點(diǎn)耐冷品種空育131和冷敏感品種龍粳11的表達(dá)量均上調(diào),但空育131表達(dá)量明顯高于龍粳11。
3.OsGH18基因的克隆及分
4、析
以冷處理12h的cDNA為模板分別對(duì)耐冷品種空育131和冷敏感品種龍粳11進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對(duì)冷脅迫相關(guān)的OsGH18基因進(jìn)行克隆,通過Blast比對(duì)、ORFFinder分析發(fā)現(xiàn)核苷酸序列之間存在密碼子的簡并性。
4.OsGH18基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化鑒定植株
采用Gateway克隆技術(shù)將OsGH18基因與植物表達(dá)載體pH7WG2相連接,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)冷敏感水稻龍粳11植株遺傳轉(zhuǎn)化,并進(jìn)行分子生
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