大鼠原發(fā)性肝癌腫瘤細(xì)胞與骨髓造血干細(xì)胞在肝癌個(gè)體化治療應(yīng)用中的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:
　　 以肝切除為代表的外科治療仍是原發(fā)性肝癌的首選治療方法。但由于原發(fā)性肝癌的早期發(fā)現(xiàn)存在困難,肝癌切除術(shù)后的5年復(fù)發(fā)率高達(dá)60％以上,切除術(shù)后的綜合治療在原發(fā)性肝癌的治療中仍然占有重要的地位?；熓蔷C合治療的主要手段之一,而各種針對(duì)原發(fā)性肝癌的臨床化療總體有效率僅為18.2％～47％,并且進(jìn)展緩慢。提供切實(shí)可行的個(gè)體化化療方案成為臨床工作者面對(duì)原發(fā)性肝癌治療上的迫切需要。
　　 隨著近年來(lái)腫瘤干細(xì)胞(TSC)理

2、論的確立,對(duì)于實(shí)體腫瘤的治療有了新的認(rèn)識(shí):TSC是腫瘤發(fā)生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等惡性生物學(xué)行為的核心,是腫瘤細(xì)胞成瘤能力的決定因素。只要存在腫瘤干細(xì)胞,腫瘤就難以治愈。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中在大鼠原發(fā)性肝癌已經(jīng)初步鑒定了具備TSC特征(極強(qiáng)的致瘤能力和自我更新并多向分化)的腫瘤細(xì)胞亞群。由此如果能夠建立一種針對(duì)原發(fā)性肝癌腫瘤干細(xì)胞的個(gè)體化化療方案,靶向殺傷腫瘤干細(xì)胞,將有希望在原發(fā)性肝癌的化療進(jìn)展上取得突破。
　　 目前對(duì)于包括肝癌

3、在內(nèi)的絕大多數(shù)實(shí)體瘤來(lái)說(shuō),缺乏鑒定TSC的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),而分離出純度高的TSC,直接進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)的技術(shù)難度、成本都比較大。較多研究表明,肝干細(xì)胞是肝細(xì)胞癌和膽管癌的祖細(xì)胞。來(lái)源于骨髓干細(xì)胞的肝卵圓細(xì)胞(Hepaticovalcell,HOC)具備肝臟干細(xì)胞性質(zhì),是肝癌干細(xì)胞的對(duì)應(yīng)成體干細(xì)胞。卵圓細(xì)胞不僅具有同骨髓干細(xì)胞相似的表面標(biāo)志,如CD34、Thy-1(CD90)、c-kit(CD117),并且在耐藥機(jī)制上也類似干細(xì)胞。骨髓干細(xì)胞分為造

4、血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞,相比較TSC而言易于分離鑒定,藥敏實(shí)驗(yàn)的可行性較高。基于上述理由,本課題利用腫瘤干細(xì)胞與骨髓干細(xì)胞的關(guān)系,重點(diǎn)研究骨髓干細(xì)胞在針對(duì)肝癌干細(xì)胞個(gè)體化化療的藥物敏感實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。
　　 目的:研究大鼠骨髓造血干細(xì)胞與大鼠原發(fā)性肝癌細(xì)胞藥敏與肝癌細(xì)胞成瘤能力的相關(guān)性；探討利用造血干細(xì)胞,進(jìn)行針對(duì)肝癌干細(xì)胞藥物敏感實(shí)驗(yàn)的可能性。并研究了藥物對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、肝癌細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的藥敏差異。
　　 方

5、法:30只雄性清潔級(jí)SD大鼠應(yīng)用0.025％二乙基亞硝胺水溶液飼喂24周建立大鼠原發(fā)性肝癌模型,選取誘癌成功大鼠8只,用組織塊法分離培養(yǎng)原代肝癌細(xì)胞；用免疫磁珠法分離骨髓造血干細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)傳代細(xì)胞表面標(biāo)志CD34。篩選五種不同作用機(jī)制抗腫瘤藥物表阿霉素、5-氟尿嘧啶(5-FU)、健擇、環(huán)磷酰胺、順鉑作用24小時(shí)后,SRB法分別檢測(cè)化療藥物對(duì)造血干細(xì)胞與肝癌細(xì)胞的抑制率。同時(shí)藥物作用后的肝癌細(xì)胞接種至裸鼠,6周后測(cè)量移植瘤重量觀察

6、其成瘤實(shí)驗(yàn)的差異,對(duì)模型大鼠造血干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞抑制率與化療藥物作用后腫瘤細(xì)胞移植裸鼠后的成瘤重量分別進(jìn)行相關(guān)性分析。另取原代培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞,同時(shí)與HepG2細(xì)胞系細(xì)胞,SRB法進(jìn)行藥物敏感實(shí)驗(yàn),觀察藥物敏感性的差異。
　　 結(jié)果:(1)表阿霉素、5-氟尿嘧啶、健擇、環(huán)磷酰胺、順鉑五種藥物對(duì)肝癌大鼠造血干細(xì)胞抑制率分別為26.44±3.14、29.72±5.05、25.98±3.34、26.91±2.70、27.21

7、±3.93；對(duì)肝癌細(xì)胞抑制率分別為:44.43±5.80、56.53±6.50、41.93±7.31、45.53±4.65、54.07±5.02。表阿霉素、5-氟尿嘧啶、健擇、環(huán)磷酰胺、順鉑五種藥物對(duì)肝癌大鼠造血干細(xì)胞抑制率與對(duì)肝癌細(xì)胞抑制率比較有顯著性差異,t值與P值分別為:t=7.051(P=0.000)；t=9.513(P=0.000)；t=7.239(P=0.000)；t=12.023(P=0.000)與t=10.091(P=0

8、.000)。(2)表阿霉素、5-氟尿嘧啶、健擇、環(huán)磷酰胺、順鉑五種藥物對(duì)肝癌細(xì)胞抑制率與其作用肝癌細(xì)胞后移植瘤重量間進(jìn)行相關(guān)分析,具體相關(guān)系數(shù)為:表阿霉素r=0.065(P=0.878)；5-氟尿嘧啶,r=0.033(P=0.939)；健擇r=-0.539(P=0.168)；環(huán)磷酰胺r=0.026(P=0.950)；順鉑r=0.600(P=0.116),均無(wú)相關(guān)性。而化療藥物對(duì)肝癌大鼠造血干細(xì)胞抑制率與對(duì)應(yīng)藥物作用后肝癌細(xì)胞移植瘤重量進(jìn)

9、行相關(guān)分析,具體相關(guān)系數(shù)為:表阿霉素r=-0.727(P=0.041)；5-氟尿嘧啶,r=-0.927(P=0.001)；健擇r=-0.901(P=0.002)；環(huán)磷酰胺r=-0.774(P=0.024)；順鉑r=-0.783(P=0.022),化療藥物對(duì)造血干細(xì)胞抑制率與肝癌細(xì)胞增殖侵襲能力有負(fù)相關(guān)性,并且相關(guān)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)阿霉素、順鉑、洛拉曲克的敏感度從高到低依次為HepG2細(xì)胞,肝癌細(xì)胞,間充質(zhì)細(xì)胞。而絲裂霉素藥敏顯示,3種細(xì)胞

10、藥物敏感度從高到低依次為HepG2,間充質(zhì)干細(xì)胞,肝癌細(xì)胞。
　　 結(jié)論:(1)選取的五種臨床常用化療藥物中,其作用機(jī)制互不相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果,同一個(gè)體的肝癌細(xì)胞和造血干細(xì)胞對(duì)不同的藥物敏感性有差異?；熕幬飳?duì)肝癌大鼠造血干細(xì)胞抑制率小于對(duì)肝癌細(xì)胞抑制率,腫瘤干細(xì)胞可能類似造血干細(xì)胞的耐藥機(jī)制。(2)化療藥物對(duì)肝癌細(xì)胞抑制率不能完全反映肝癌細(xì)胞增殖侵襲能力?；熕幬飳?duì)造血干細(xì)胞抑制率相對(duì)于肝癌細(xì)胞可以較好反映腫瘤細(xì).胞增殖侵襲能力。