環(huán)磷酰胺致大鼠低轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松及復(fù)方丹參制劑的預(yù)防作用.pdf

1、用環(huán)磷酰胺造成大鼠低轉(zhuǎn)換骨質(zhì)疏松模型，觀察復(fù)方丹參制劑的預(yù)防作用，并與陽(yáng)性對(duì)照藥物碳酸鈣維D進(jìn)行比較；為低轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松模型的建立及復(fù)方丹參制劑的二次開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 【方法】 實(shí)驗(yàn)藥物的制備及質(zhì)量控制：取6批丹參和三七的中藥材，據(jù)2005版藥典所記載的復(fù)方丹參滴丸提取方法制備復(fù)方丹參制劑，隨機(jī)編為1<'＃>、2<'＃>、3<'＃>、4<'＃>、5<'＃>、6<'＃>，并通過(guò)高效液相色譜法(色譜柱：Agilient C

2、<,18>(250mm×4.65um，5um)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.6％磷酸(B)，程序梯度洗脫：2％A(0min)-5％A(10min)-20％A(30min)-80％A(80min)；流速：1.0ml/min；溫度為25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；進(jìn)樣量：10ul。)，制備其指紋圖譜并考查其精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性，并擬合丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B的標(biāo)準(zhǔn)曲線、計(jì)算1<'＃>復(fù)方丹參制劑和復(fù)方丹參滴丸(天力士制藥股份有限公司，批號(hào)：Z

3、10950111)中三者的含量及比例。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：50只3月齡SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，隨機(jī)分成5組。1組為蒸餾水處理組(NS組)，其余4組先予大鼠灌喂4.5mg/kg/d的環(huán)磷酰胺造成骨質(zhì)疏松的動(dòng)物模型，然后分成環(huán)磷酰胺模型組(CP)、碳酸鈣維D組(CS)、復(fù)方丹參制劑低劑量組(FDL)和高量組(FDH)，分別灌喂蒸餾水(CP)、碳酸鈣維D(CS)0.4mg/kg/d、復(fù)方丹參制劑低劑量(FDL)2.13g/kg/d、高劑量

4、(FDH)6.39g/kg/d，每天一次，連續(xù)15d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前13、14天和3、4天分別注射四環(huán)素和鈣黃綠素作骨熒光標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，心臟取血處死大鼠，取左側(cè)脛骨不脫鈣包埋后分別制成骨切片和骨磨片，通過(guò)半自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行松質(zhì)骨(上段)和皮質(zhì)骨(中段)的骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)測(cè)量；用858 Mini Bionix型材料測(cè)試系統(tǒng)分析大鼠第五腰椎(壓縮實(shí)驗(yàn))和右側(cè)股骨(三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn))的生物力學(xué)性能；最后，將生物力學(xué)檢測(cè)后的骨材料烘干、消化，分

5、成兩份，分別使用ICP離子性發(fā)射光譜儀和羥脯氨酸試劑盒(經(jīng)典法)檢測(cè)其骨鈣、磷、鎂以及骨膠原的含量。 【結(jié)果】 1．復(fù)方丹參制劑的指紋圖譜及主要成分含量測(cè)定 本研究制備的復(fù)方丹參制劑的指紋圖譜見(jiàn)圖3.5(page39)，通過(guò)對(duì)該指紋圖譜的精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性的考察，獲得各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間及峰面積比值RSD％分別為0．2％～2％的結(jié)果，該結(jié)果符合指紋圖譜所需要求，表明該復(fù)方制劑工藝穩(wěn)定、質(zhì)量可控。 丹

6、參素、原兒茶醛、丹酚酸B三種的標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3.1～3.4(page32～33)，圖譜見(jiàn)圖3.7(page40)。 根據(jù)丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B三種的標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線及圖譜，計(jì)算出本實(shí)驗(yàn)的復(fù)方丹參制劑中丹參素的含量為1.74mg/g；原兒茶醛的含量為0.11mg/g；丹酚酸B的含量為17.89mg/g；三者比例為1:0.06:10。對(duì)照藥品復(fù)方丹參滴丸中丹參素的含量2.00mg/g；原兒茶醛的含量為0.54mg/g；丹酚酸B

7、的含量為0.56mg/g;三者比例為1:0.27:0.28。其指紋圖譜見(jiàn)圖3.6(page40)。 經(jīng)檢測(cè)得知：低劑量的復(fù)方丹參制劑含丹參素O．74m咖1；原兒茶醛0.047mg/ml；丹酚酸B 7.62mg/ml。高劑量的復(fù)方丹參制劑含丹參素2.22mg/ml；原兒茶醛0.14mg/ml；丹酚酸B 22.9mg/ml。 2．環(huán)磷酰胺可使大鼠骨形成明顯抑制：與NS組比較，大鼠予環(huán)磷酰胺灌喂15d后，骨形成作用受到抑制，骨

8、量顯著丟失，骨生物力學(xué)性能明顯下降。表現(xiàn)在： ①松質(zhì)骨的骨量明顯減少，顯微結(jié)構(gòu)疏松退化。骨形態(tài)計(jì)量學(xué)研究觀察到脛骨上段的靜態(tài)參數(shù)中骨小梁面積百分率(％Tb．Ar)、骨小梁厚度(Tb．Th)和骨小梁數(shù)量(Tb．N)分別降低了48.7％、18％與37.8％；骨小梁分離度(Tb．Sp)增加了67.8％。 ②松質(zhì)骨反映骨形成及骨礦化的指標(biāo)明顯下降。骨形態(tài)計(jì)量學(xué)研究觀察到熒光周長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)(％L．Pm)、骨礦化沉積率(MAR)、骨形成

9、率(BFR/BS、BFR/BV、BFRJTV)分別降低了50.8％、21.6％、61.1％、50％和72.2％。 ③皮質(zhì)骨的骨量明顯減少，骨髓腔增大，骨的形成和礦化被抑制。骨形態(tài)計(jì)量學(xué)研究觀察到脛骨中段骨的皮質(zhì)面積(Ct.Ar)下降15％，皮質(zhì)面積百分?jǐn)?shù)(％Ct.Ar)下降3.59％，骨髓面積百分?jǐn)?shù)(％Ma．Ar)增加15.0％，骨外膜礦化沉積率(P-MAR)下降30.7％，骨形成率(P-FBR/BS)下降28.1％，以上差異均

10、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 ④股骨和腰椎變得脆而易碎，骨折風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。骨生物力學(xué)檢測(cè)觀察到股骨、腰椎的最大載荷分別下降了14.8％和21.6％，彈性模量分別下降了27.7％和29.8％。 ⑤股骨單位骨量中的骨羥脯胺酸(Hyp)顯著降低(P<0.05)，股骨和腰椎單位骨量中的骨鈣、磷、鎂的含量均顯著降低(P<0.05)。 3．碳酸鈣維D可明顯促進(jìn)環(huán)磷酰胺大鼠的骨形成和骨礦化作用：與CP組比較，碳酸鈣維D能顯著對(duì)抗環(huán)磷酰胺造成

11、的骨丟失和骨形成抑制，有效提高骨質(zhì)量，降低骨折風(fēng)險(xiǎn)，表現(xiàn)在： ①松質(zhì)骨的骨量明顯增加，結(jié)構(gòu)緊密。骨形態(tài)計(jì)量學(xué)觀察到脛骨上段的靜態(tài)參數(shù)中％Tb．Ar、Tb．Th和Tb．N分別升高了82％、23.4％與45.5％。Tb．Sp減少了33.3％。 ②松質(zhì)骨反映骨形成和骨礦化的指標(biāo)明顯上升。骨形態(tài)計(jì)量學(xué)研究觀察到％L．Pm、MAR、BFR/BS、BFR/BV分別升高了196.6％、68.8％、430.2％和320.9％。

12、③皮質(zhì)骨的骨量明顯增加，骨髓腔縮小，骨的形成、礦化作用增強(qiáng)。骨形態(tài)計(jì)量學(xué)研究觀察到％Ct．Ar、P-MAR、P-FBR/BS分別增長(zhǎng)4.63％、36.3％、53.3％，％Ma．Ar則下降16.2％，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 ④股骨和腰椎硬度明顯增加，骨折風(fēng)險(xiǎn)顯著下降。骨生物力學(xué)檢測(cè)觀察到股骨、腰椎的最大載荷分別增加了28.5％和15.5％，彈性模量分別增加了69.7％和38.3％。 ⑤股骨單位骨重量中的骨Hyp顯著增加(P<

13、0.05)，股骨和腰椎單位骨量中的骨鈣、磷、鎂的含量均顯著升高(P<0.05)。 4．高、低劑量的復(fù)方丹參制劑均可明顯促進(jìn)環(huán)磷酰胺大鼠的骨形成和骨礦化作用：與CP組比較，高、低劑量均可有效對(duì)抗環(huán)磷酰胺所造成的大鼠骨丟失和骨形成抑制作用，能有效地增加股骨的生物力學(xué)性能，降低骨折風(fēng)險(xiǎn)。表現(xiàn)在： ①松質(zhì)骨的骨量明顯增加，結(jié)構(gòu)致密有序。骨形態(tài)計(jì)量學(xué)觀察到低、高劑量的復(fù)方丹參制劑分別使脛骨上段靜態(tài)參數(shù)中的％Tb．Ar增加108.2

14、％和124.6％，Tb.Th增加25.1％和39.1％，Tb.N增加62.8％和61.4％。Tb.Sp減少了36.3％和40.1％。 ②松質(zhì)骨反映骨形成和骨礦化的指標(biāo)明顯上升。骨形態(tài)計(jì)量學(xué)觀察到低劑量的復(fù)方丹參制劑使％L.Pm、MAR、BFR/BS、BFR/BV分別升高了83.5％、61.4％、201.8％和127.2％。高劑量的復(fù)方丹參制劑則使％L-Pm、MAR、BFR/BS、BFR/BV、BFR/TV分別升高了203.8％

15、、74％、458.7％、279.3％和610.3％。 ③高、低劑量的復(fù)方丹參制劑均可明顯增加皮質(zhì)骨的形成礦化活性，但骨量的增加，高劑量?jī)?yōu)于低劑量。骨形態(tài)計(jì)量學(xué)觀察到高劑量組的％Ct.Ar、P.MAR、P-FBR/BS分別增長(zhǎng)5.65％、27.8％、57.2％，％Ma.Ar降低19.8％，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；低劑量組中P-MAR、P-FBR/BS的增長(zhǎng)率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而％Ct.Ar和％Ma.Ar僅有一定的改善趨勢(shì)，差異卻不具統(tǒng)計(jì)

16、學(xué)意義。 ④股骨和腰椎硬度明顯增加，骨折風(fēng)險(xiǎn)顯著下降。骨生物力學(xué)觀察到高、低劑量的復(fù)方丹參制劑分別使股骨的最大載荷分別增加了19.5％和29.5％，彈性模量分別增加了71.8％和57.8％；腰椎的最大載荷分別增加了18％和24％，彈性模量分別增加了38.1％和28.8％。 ⑤股骨單位骨量中的骨Hyp顯著增加(P<0.05)，股骨和腰椎單位骨量中的骨鈣、磷、鎂的含量均顯著升高(P<0.05)。 【結(jié)論】 每

17、天按4.5mg/kg大鼠體重的劑量連續(xù)給予環(huán)磷酰胺15天，可明顯抑制大鼠的骨形成，導(dǎo)致骨丟失，并且降低骨的力學(xué)質(zhì)量，骨形態(tài)計(jì)量學(xué)觀察呈現(xiàn)低轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松的典型表現(xiàn)；碳酸鈣維D可有效預(yù)防環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的大鼠骨改變；按藥典的方法制備的復(fù)方丹參制劑，對(duì)環(huán)磷酰胺導(dǎo)致大鼠的骨改變也有明顯的抑制作用。此外，在促進(jìn)骨形成，提高骨質(zhì)量上比碳酸鈣維D表現(xiàn)出更加優(yōu)秀的作用，具有成為理想的抗骨質(zhì)疏松藥物的潛質(zhì)。本研究通過(guò)指紋圖譜的分析，觀察到復(fù)方丹參制劑具有工