1型干擾素受體以及Th-17在慢性肝病中的變化及其意義.pdf

1、第一部分：Ⅰ型干擾素受體和I L-17及其受體在慢性乙型病毒性肝炎患者中的變化
　　 研究背景：干擾素-alpha(IFN-α)是治療慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者的一線抗病毒藥物，Ⅰ型干擾素受體(IFNAR)在干擾素α的起效作用過程中至關(guān)重要，已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)輔助性T17細(xì)胞(Th17)可能參與CHB的發(fā)病機(jī)制。然而慢性乙型病毒性肝炎患者體內(nèi)IFNAR的變化以及其在干擾素a2b治療療效評價中的作用尚不清楚，而且IFNAR與Th1

2、7分泌的白介素17(IL-17)之間的關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。
　　 研究目的：本研究檢測了慢性乙肝患者體內(nèi)外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)以及肝組織內(nèi)IFNAR以及IL-17及其受體的變化以揭示IFNAR其在應(yīng)用干擾素α2b治療療效預(yù)測中的作用，同時探討慢性乙型病毒性肝炎患者IFNAR與IL-17的關(guān)系。
　　 研究方法：共入選84例慢性乙型病毒性肝炎患者以及10例健康志愿者，其中25例接受了肝穿刺活檢術(shù)。84例慢性乙肝患

3、者中有25例符合抗病毒治療的患者接受至少3個月的干擾素α2b治療。分離PBMCs，淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞內(nèi)IFN-α/β R-1和IFN-α/β R-2的表達(dá)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測定，提取PBMCs中的RNA，IFNAR1，IFNAR2，IL-6，IL-8，IL-17A，IL-17F，IL-17RA，IL-17RC，TGF-β1和TNF-α的mRNA水平用SYBRGreen RT-PCR進(jìn)行監(jiān)測。肝組織中IFNAR-1和IFNAR-2用免疫熒

4、光以及免疫組化染色進(jìn)行觀察。提取肝組織RNA，RT-PCR檢測肝組織內(nèi)IFNAR1，IFNAR2，IL-6，IL-8，IL-17A，IL-17F，IL-17RA，IL-17RC，TGF-β1和TNF-α的mRNA水平。在應(yīng)用干擾素α2b治療的患者中，每一個月監(jiān)測外周血淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞內(nèi)IFN-α/β R-1和IFN-α/βR-2的表達(dá)以及外周血單個核細(xì)胞內(nèi)IFNAR1，IFNAR2，IL-17A，IL-17F，IL-17RA和IL-

5、17RC的mRNA變化。
　　 研究結(jié)果：慢性乙肝患者外周血單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中IFN-α/β R-1和IFN-α/β R-2的表達(dá)升高，肝組織內(nèi)IFNAR-1和IFNAR-2的水平也明顯升高，并與與肝組織HBV-DNA正相關(guān)。在應(yīng)用干擾素α2b治療的慢性乙肝患者中，單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞內(nèi)IFN-α/β R-1和IFN-α/βB R-2的表達(dá)在第一個月明顯升高，而在隨后的兩個月治療中逐步降低。在治療應(yīng)答組(12/25)單核細(xì)胞和淋

6、巴細(xì)胞中IFN-α/β R-1和IFN-α/βB R-2的表達(dá)明顯高于非應(yīng)答組(13/25)。治療前單核細(xì)胞內(nèi)IFNα/β R-2表達(dá)較高的患者其干擾素應(yīng)答率明顯高于較低的患者。另外慢性乙型病毒性肝炎患者肝組織和PBMC中IFNAR，IL-17A，IL-17F，IL-17RA，IL-17RC，IL-6，IL-8，TGF-β1和TNF-α的表達(dá)明顯升高，IL-17及其受體的表達(dá)與血清轉(zhuǎn)氨酶的水平呈正相關(guān)，并且與炎癥細(xì)胞因子IL-6，IL-

7、8，TGF-β1和TNF-α的水平呈正相關(guān)。PBMCs中IFN-α/β R1和IFN-α/β R2的表達(dá)與IL-17及其受體呈負(fù)相關(guān)，并且隨著干擾素的應(yīng)用，IL-17及其受體的水平明顯降低。
　　 結(jié)論：慢性乙型病毒性肝炎外周血單個核細(xì)胞以及肝組織內(nèi)IFN-α/β R-1和IFN-α/β R-2的表達(dá)升高。在干擾素治療有效組，其外周淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞IFNAR的表達(dá)均高于無效組，提示IFNAR在外周血單個核細(xì)胞的表達(dá)影響干擾素的

8、療效；干擾素治療前，外周血單核細(xì)胞表面IFNAR-2的表達(dá)可以作為預(yù)測干擾素治療慢性乙型病毒性肝炎療效的預(yù)測指標(biāo)。
　　 第二部分：I L-17及其信號系統(tǒng)參與肝纖維化的形成
　　 研究背景：研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生IL-17的Th17細(xì)胞與慢性炎癥反應(yīng)以及自身免疫性疾病廣泛相關(guān)。而且我們發(fā)現(xiàn)慢性乙型病毒性肝炎患者外周血單個核細(xì)胞以及肝組織內(nèi)IL-17及其受體的水平明顯升高。提示Th17可能參與慢性肝病的發(fā)病機(jī)制。近來有研究發(fā)現(xiàn)IL

9、-17可以導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化，為我們進(jìn)一步探討IL-17在肝纖維化發(fā)病中的作用提供了依據(jù)。
　　 研究目標(biāo)：確定IL-17在肝纖維化發(fā)病機(jī)制中的作用，包括IL-17對肝臟枯否氏細(xì)胞以及肝星狀細(xì)胞的激活作用，以及其在肝臟原代細(xì)胞中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　 研究方法：應(yīng)用IL-17A和IL-17F刺激人LX-2和hTERT(human telomerasereverse transcriptase)星狀細(xì)胞株，分析IL-17對星狀細(xì)

10、胞株的激活作用以及其在星狀細(xì)胞株中的信號傳導(dǎo)。星狀細(xì)胞α-SMA，collagenα1(Ⅰ)，TGF-β1和TIMP1mRNA的表達(dá)用RT-PCR方法檢測，IL-17誘導(dǎo)的ERK1/2(ERK)，AKT(serine Threonine Kinase)和NF-κB(nuclear factorκ B)的磷酸化用Western blot方法檢測，NF-κ B在星狀細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核內(nèi)移位用細(xì)胞免疫熒光染色觀察。
　　 分離原代肝臟枯否

11、氏細(xì)胞、星狀細(xì)胞和肝細(xì)胞，分別應(yīng)用IL-17A，IL-17F以及IL-17A+IL-17F進(jìn)行刺激，IL-17對肝臟原代肝臟枯否氏細(xì)胞、星狀細(xì)胞和肝細(xì)胞的作用用RT-PCR，Western blot以及細(xì)胞免疫熒光的方法進(jìn)行檢測，IL-17A依賴的膠原蛋白激活的機(jī)制進(jìn)一步由體外實(shí)驗(yàn)野生型以及IL-17R敲除型collagen-GFP小鼠原代星狀細(xì)胞中加以證實(shí)。利用純合子STAT3 floxed等位基因(homozygous for ST

12、AT3 floxedallele STAT3f1/f1)小鼠與(膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白-cre GFAP-cre)小鼠進(jìn)行雜交，獲得定靶于星狀細(xì)胞敲除STAT3的小鼠，分離小鼠的星狀細(xì)胞，應(yīng)用IL-17A進(jìn)行刺激，觀察星狀細(xì)胞的活化情況，應(yīng)用STAT3f1/f1小鼠作為對照。從而確定IL-17A對星狀細(xì)胞的激活是否依賴于STAT3的激活。
　　 野生型(WT)以及IL-17RA敲除型小鼠用膽總管結(jié)扎(BDL)和四氯化碳(CCl4

13、)腹腔內(nèi)注射誘導(dǎo)肝纖維化，通過天狼腥紅(Sirius Red)染色觀察肝組織病理，分離BDL模型組以及對照組肝臟內(nèi)實(shí)質(zhì)性細(xì)胞(NPCs)。用流式細(xì)胞儀檢測NPCs各細(xì)胞群中IL-17A的表達(dá)。α-SMA免疫組化染色評估肝纖維化的程度，提取肝組織RNA，RT-PCR評估肝組織內(nèi)MMP3，TIMP，TNF-α，TGF-β1，IL-6，IL-1-β的表達(dá)。提取肝組織蛋白質(zhì)Western-blot檢測肝組織蛋白中α-SMA的表達(dá)。
　　

14、 研究結(jié)果：IL-17A在體外實(shí)驗(yàn)中可以激活枯否氏細(xì)胞(表達(dá)IL-17A，IL-17F，TGF-β1，IL-6 and IL-1-β)以及肝臟星狀細(xì)胞(表達(dá)α-SMA，and TIMP1)，表明IL-17A可以獨(dú)立激活枯否氏細(xì)胞以及產(chǎn)膠原細(xì)胞。IL-17A激活星狀細(xì)胞的信號通路包括STAT3，ERK1/2，AKT，NF-κ B的磷酸化，其中STAT3的磷酸化是IL-17A激活星狀細(xì)胞的首要信號通路，定靶于星狀細(xì)胞敲除STAT3后，IL-

15、17A激活星狀細(xì)胞的功能被明顯阻斷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)清除IL-17A信號通路(在IL-17RA敲除型小鼠)與野生型相比可以明顯減輕BDL(65±7％)以及CCl4(45±8％)誘導(dǎo)產(chǎn)生的肝纖維化。BDL誘導(dǎo)的肝纖維化模型中IL-17A主要在炎癥細(xì)胞中明顯升高(CD4+，CD8+T cells>Kupffer cells)。IL-17A的作用與星狀細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)增高相關(guān)，結(jié)論：IL-17在肝纖維化的發(fā)病機(jī)制中有重要的作用，IL-1

16、7A可以明顯激活肝臟枯否氏細(xì)胞和星狀細(xì)胞，IL-17A激活星狀細(xì)胞主要依賴于STAT3的磷酸化。
　　 第三部分：枯否氏細(xì)胞IL-17A/IL-17RA信號通路在Th17導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要
　　 研究背景：枯否氏細(xì)胞被認(rèn)為是參與肝內(nèi)炎癥反應(yīng)的首要靶細(xì)胞。在肝臟受損傷后，枯否氏細(xì)胞可以激活并釋放一系列驗(yàn)證前細(xì)胞因子以及活性氧介質(zhì)，可以激活星狀細(xì)胞，從而導(dǎo)致肝纖維化。研究發(fā)現(xiàn)IL-17可以激活枯否氏細(xì)胞和星狀細(xì)

17、胞，敲除IL-17RA可以明顯減輕由BDL和CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化。同時發(fā)現(xiàn)IL-17在體外激活枯否氏細(xì)胞的作用明顯強(qiáng)于星狀細(xì)胞。為此應(yīng)用體外枯否氏細(xì)胞與星狀細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，體內(nèi)進(jìn)行IL-17RA-/-和WT小鼠之間的骨髓移植(BMT)，試圖揭示IL-17導(dǎo)致肝纖維化的機(jī)制。
　　 研究目標(biāo)：確定IL-17導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)病機(jī)制，探討枯否氏細(xì)胞和星狀細(xì)胞內(nèi)IL-17及其信號通路在肝纖維化發(fā)病機(jī)制中的地位。
　　 研究方法：

18、體外實(shí)驗(yàn)中分離WT和IL-17RA-/-小鼠原代枯否氏細(xì)胞，同時分離WT-collage-GFP和IL-17R-/-collagen-GFP小鼠原代星狀細(xì)胞，聯(lián)合培養(yǎng)后應(yīng)用IL-17A進(jìn)行刺激24小時，觀察星狀細(xì)胞表達(dá)膠原蛋白-GFP的陽性率。
　　 體內(nèi)試驗(yàn)采用了骨髓移植的實(shí)驗(yàn)方法，受體小鼠經(jīng)氯膦酸鹽脂質(zhì)體(Clodronate-Liposomes)靜脈注射清除單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和放射性照射清除淋巴細(xì)胞之后完成IL-17A-/

19、-，IL-17RA-/-與WT小鼠之間的骨髓移植，共獲得5組嵌合體小鼠，分別為：WT移植入WT組(枯否氏細(xì)胞為野生型，HSCs為野生型)；IL-17A-/-移植入WT組(枯否氏細(xì)胞無IL-17A；HSCs為野生型)；WT移植入IL-17RA-/-組(枯否氏細(xì)胞為野生型，HSCs無IL-17RA)；IL-17RA-/-移植入WT組(枯否氏細(xì)胞無IL-17RA，HSCs為野生型)以及IL-17RA-/-移植入IL-17RA-/-組(枯否氏細(xì)

20、胞和HSCs均無IL-17RA)。2個月后嵌合體小鼠行膽管結(jié)扎構(gòu)建肝纖維化模型，通過天狼腥紅染色(Sirius Red)，α-SMA免疫組化染色以及RT-PCR評估肝纖維化。
　　 研究結(jié)果：WT枯否氏細(xì)胞與IL-17RA-/--collagen-GFP星狀細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)組經(jīng)IL-17A刺激24小時后，其星狀細(xì)胞表達(dá)collagen-GFP的陽性率明顯高于IL-17RA-/-枯否氏細(xì)胞與WT-collagen-GFP星狀細(xì)胞聯(lián)合培

21、養(yǎng)組(34±11％比25±7％)。而在骨髓移植實(shí)驗(yàn)中，清除骨髓來源的IL-17A/IL-17RA信號通路系統(tǒng)(IL-17RA-/-移植入WT或者IL-17A-/-移植入WT)組，可以分別減輕肝纖維化55±9％和50±12％。但是清除肝臟內(nèi)生性細(xì)胞(肝細(xì)胞和星狀細(xì)胞)IL-17A/IL-17RA信號通路組(WT移植入IL-17RA-/-)，其肝纖維化程度仍有所減輕，但不是很明顯(25±7％)。
　　 結(jié)論：枯否氏細(xì)胞內(nèi)IL-17A