哺乳期2，3，7，8-四氯二苯-對(duì)-二惡英低水平暴露對(duì)仔鼠神經(jīng)發(fā)育的影響.pdf

1、目的: 2，3，7，8-四氯二苯-對(duì)-二惡英(2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)是地球上毒性最強(qiáng)的化合物之一，國際癌癥研究中心(International Agency forResearch on Cancer，IARC)將其列為Ⅰ級(jí)致癌物。世界衛(wèi)生組織(WHO)等機(jī)構(gòu)認(rèn)為，雖然TCDD是強(qiáng)致癌物，但就目前其暴露背景而言，TCDD的非致癌毒性作用比致癌毒性作用對(duì)人體健康危害的風(fēng)險(xiǎn)

2、更大。此外，TCDD具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、半衰期長(zhǎng)的特性，僅需暴露一次就可以長(zhǎng)期留存體內(nèi)，長(zhǎng)期接觸可造成體內(nèi)蓄積，造成嚴(yán)重的機(jī)體毒害作用。 由于幼鼠對(duì)TCDD高度敏感，所以本研究在雌性小鼠分娩后立即經(jīng)腹腔注射低劑量TCDD，通過乳汁對(duì)仔鼠染毒，然后觀察哺乳期暴露于TCDD對(duì)仔鼠體重增長(zhǎng)、神經(jīng)發(fā)育和學(xué)習(xí)記憶的影響，大腦海馬和皮層組織結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞色素P450 1A1酶(cytochrome P450 1A1，CYP1A1)、凋亡基因Bc1－

3、2(B-Cell lymphoma/leukemia 2)和Bax(Bcl－associated x protein)蛋白表達(dá)量的變化，為低劑量TCDD造成的子代慢性神經(jīng)系統(tǒng)危害及其機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。 方法: 1.動(dòng)物模型建立與分組4 月齡健康成年昆明小鼠，雌鼠24只，雄鼠8只，按照3:1的雌雄比例同籠受孕。分娩7～10只仔鼠的保留，調(diào)整每窩仔鼠8只，雌雄對(duì)半，其余淘汰。將母鼠和仔鼠作為整體(窩)進(jìn)行完全隨機(jī)分組，設(shè)2個(gè)

4、試驗(yàn)組：4μg和2μgTCDD/kg體重組；與試驗(yàn)組對(duì)應(yīng)，設(shè)2個(gè)溶劑對(duì)照組：4μg和2μg溶劑對(duì)照組；另設(shè)1個(gè)不做任何處理的空白對(duì)照組；共5組，每組3窩(5個(gè)試驗(yàn)組以下簡(jiǎn)寫為40μg TCDD組、2μg TCDD組、4μg溶劑對(duì)照組、20μg溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組)。雌鼠分娩之后，立即稱重并進(jìn)行腹腔注射。母鼠哺乳仔鼠(即染毒)至仔鼠出生后第21天，而后停止哺乳，讓仔鼠自由進(jìn)食。仔鼠出生后第35天被處死。 TCDD濃度為10μ/ml(TC

5、DD/甲苯)，純度為99％，腹腔注射前將該試劑用花生油稀釋，體積比為TCDD：花生油=1:4，則濃度稀釋為2μG/ml。溶劑對(duì)照為甲苯和花生油按1:4體積比混合的混合液。 2.仔鼠體重的測(cè)定 3.仔鼠神經(jīng)發(fā)育指標(biāo)的測(cè)定(平面翻正試驗(yàn)、負(fù)趨地試驗(yàn)、前肢握力試驗(yàn)、空中翻正試驗(yàn)、足展開試驗(yàn)) 4 仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力的測(cè)定(Y迷宮試驗(yàn)) 5 采用免疫組織化學(xué)染色方法對(duì)仔鼠大腦海馬和皮層組織CYP1A1蛋白進(jìn)行定位和

6、半定量分析。 6 仔鼠大腦海馬和皮層組織細(xì)胞凋亡的測(cè)定 6.1 采用H.E染色法觀察仔鼠大腦海馬和皮層組織的結(jié)構(gòu)變化 6.2 采用免疫組織化學(xué)染色法對(duì)仔鼠大腦海馬和皮層組織Bcl-2和Bax凋亡蛋白進(jìn)行定位和半定量分析。 6.3 采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)仔鼠大腦海馬和皮層組織Bcl-2Bax蛋白表達(dá)量進(jìn)行定量分析 結(jié)果: 1.TCDD對(duì)仔鼠體重的影響新生仔鼠體重基本相同(P＞0.05)；出生后第7

7、天，20μgTCDD組仔鼠的平均體重低于其溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組(P＜0.01)；隨著TCDD的攝入和蓄積，40μg和20μg TCDD組仔鼠的平均體重均低于相應(yīng)的溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組(P＜0.01)，并且40μg TCDD組仔鼠的平均體重低于20μgTCDD組(P＜0.05)；停止染毒后(出生后第28天和第35天)，暴露于TCDD仔鼠的平均體重依然低于相應(yīng)的溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組(P＜0.01)。 2.TCDD對(duì)仔鼠神經(jīng)發(fā)育

8、的影響哺乳期暴露于TCDD的仔鼠的平面翻正和負(fù)趨地時(shí)間大于相應(yīng)的溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組，前肢握力時(shí)間和足展開距離小于相應(yīng)的溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組，空中翻正正確率低于相應(yīng)的溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。 3.TCDD對(duì)仔鼠學(xué)習(xí)記憶的影響在Y迷宮測(cè)試中，哺乳期暴露于TCDD的仔鼠獲取記憶的能力(A)、保持記憶的能力(B)和記憶保持率(C)均低于相應(yīng)的溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組，其差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01

9、.)。 4 TCDD對(duì)仔鼠大腦海馬和皮層組織CYP1A1蛋白表達(dá)量的影響CYP1A1蛋白主要表達(dá)于仔鼠大腦海馬和皮層組織錐體細(xì)胞的胞漿中。哺乳期低劑量暴露于TCDD可使仔鼠大腦錐體細(xì)胞CYP1A1蛋白的表達(dá)量增高(P＜0.01)，各組雌性仔鼠的CYP1A1蛋白表達(dá)量略高于雄性仔鼠，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 5 TCDD對(duì)仔鼠大腦海馬和皮層組織細(xì)胞凋亡的影響哺乳期低劑量暴露于TCDD的仔鼠的大腦海馬和皮層組織錐

10、體細(xì)胞排列紊亂，胞體皺縮，核染色質(zhì)濃集，呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。 凋亡基因Bcl-2主要表達(dá)于仔鼠大腦錐體細(xì)胞的胞漿中，并且存在性別差異，雌性仔鼠高于雄性(P＜0.01)。哺乳期低劑量暴露于TCDD可使雌雄性仔鼠大腦錐體細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)量減低(P＜0.01)，但雌性仔鼠Bcl-2蛋白表達(dá)量始終高于雄性(P＜0.01)。 凋亡基因Bax主要表達(dá)于仔鼠大腦錐體細(xì)胞的胞漿和胞核中，表達(dá)量不存在性別差異(P＞0.05)。哺乳期

11、低劑量暴露于TCDD可使雌雄性仔鼠大腦錐體細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)量增高(P＜0.01)，并且雌性仔鼠增高較雄性明顯，存在性別差異(P＜0.05)。 TCDD可以使雌雄仔鼠大腦錐體細(xì)胞Bcl-2/Bax比值降低(P＜0.01)，說明TCDD可以誘導(dǎo)雌雄仔鼠海馬和皮層組織錐體細(xì)胞凋亡。并且雄性仔鼠Bcl-2/Bax比值較雌性低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，說明雄性仔鼠比雌性的細(xì)胞凋亡率高。 結(jié)論: 1.哺乳期低

12、劑量暴露于TCDD，可以阻礙仔鼠的體重增長(zhǎng)，并且這種阻礙作用并不隨著染毒的停止而停止，具有持續(xù)性。 2.哺乳期低劑量暴露于TCDD，可以使仔鼠的神經(jīng)反射功能下降，運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力降低，肌張力減退，神經(jīng)發(fā)育遲緩。并且接觸量越大，蓄積量越多，對(duì)神經(jīng)發(fā)育的影響越明顯。 3.哺乳期低劑量暴露于TCDD，可以使仔鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降，危險(xiǎn)回避能力受損。 4 哺乳期低劑量暴露于TCDD，可以使仔鼠大腦海馬和皮層組織CYP1A1蛋

13、白表達(dá)量增加，說明血腦屏障對(duì)TCDD的阻隔作用有限，TCDD可以通過尚未發(fā)育好的血腦屏障進(jìn)入腦組織，造成海馬和皮層組織錐體細(xì)胞的損傷，這可能是TCDD導(dǎo)致子代神經(jīng)發(fā)育遲緩，學(xué)習(xí)記憶能力下降的重要途徑之一。 5 哺乳期低劑量暴露于TCDD，可以誘導(dǎo)仔鼠大腦海馬和皮層組織錐體細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡改變，可以使Bcl-2蛋白表達(dá)量減低，Bax蛋白表達(dá)量增高，Bcl-2/Bax比值降低。Bcl-2凋亡基因家族比值的改變可能是TCDD導(dǎo)致細(xì)胞異常凋